白姜花離體植株再生及其花瓣ACC氧化酶基因克隆的研究.pdf

1、白姜花(Hedychiumcoronarium)為姜科姜花屬一種多年生草本植物，又被稱作“蝴蝶花”、“蝴蝶姜”或“蝴蝶百合”，因其花色潔白、花型美麗、花香宜人，在我國(guó)南方廣泛栽培并主要用作香型切花、庭院綠化和園林景觀植物。然而，白姜花切花的瓶插壽命相對(duì)于康乃馨、月季、菊花、百合等切花品種要短的多，一般只有2-3天。前人的研究結(jié)果表明，在白姜花的瓶插開(kāi)花和衰老過(guò)程中，整個(gè)花序有較為典型的乙烯釋放高峰的出現(xiàn)，而且外源乙烯處理加速花朵的衰老，

2、而乙烯合成或作用抑制劑(STS、AOA)處理則有利于瓶插期的延長(zhǎng)，這正與許多乙烯躍變型切花非常相似。 近年來(lái)，也有部分研究者開(kāi)展了對(duì)白姜花切花衰老和保鮮問(wèn)題的探討，但最終未能從根本上解決問(wèn)題。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入乙烯合成相關(guān)反義基因或利用RNAi技術(shù)，抑制白姜花切花的乙烯合成，從而獲得花期延長(zhǎng)的白姜花新品種是非常值得探索的育種途徑。為此，本論文以廣州本地白姜花品種為試材，首先，就外植體類型、培養(yǎng)條件和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等

3、因素優(yōu)化了白姜花間接器官發(fā)生的植株再生培養(yǎng)體系；然后，提取處于衰老期花瓣的總RNA，運(yùn)用RT-PCR法克隆到白姜花ACC氧化酶基因的cDNA片斷，為進(jìn)一步反義植物表達(dá)載體的構(gòu)建及目的基因的轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.優(yōu)化并建立了白姜花花絲愈傷組織的植株再生途徑。研究結(jié)果表明：將花絲愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D濃度由4.0mg/L提高至5.0mg/L，能加快花絲愈傷組織的增殖，其繼代30天后的凈增殖量分別為0.94g

4、和2.01g，同時(shí)，在一定程度上也減少了愈傷組織的褐變，利于繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)3-4次的花絲愈傷組織在添加了0.1mg/LTDZ和0.2mg/LNAA的分化培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)率最高，平均每塊愈傷組織的不定芽數(shù)為3.6±0.32；不定芽另轉(zhuǎn)至添加了3.0mg/L6-BA的PM4培養(yǎng)基上培養(yǎng)，芽增殖指數(shù)(SPI)高達(dá)4.1，而且不定芽均能正常伸長(zhǎng)生長(zhǎng)；愈傷組織誘導(dǎo)出的不定芽在添加30g/L葡萄糖、0.5mg/LIBA和0.2mg/LNAA的1/

5、2MS(含1.0％活性炭)培養(yǎng)基上生根效果最好，培養(yǎng)2周左右時(shí)間出根，平均每個(gè)不定芽的生根數(shù)為16.4±0.52； 2.建立了白姜花假莖薄片愈傷組織的植株再生途徑。試驗(yàn)結(jié)果表明：以白姜花的假莖薄片為外植體，其最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B5+7.0μmol/LDicamba+0.175mg/LIAA，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)87.4％。在所試的13種IAA和不同濃度Dicamba或2，4-D組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共獲得三種類型愈傷組織(Ⅰ型、

6、Ⅱ型和Ⅲ型)，其中，Ⅰ型和Ⅲ型愈傷組織在Dicamba和IAA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生，而Ⅱ型愈傷組織則由2，4-D與IAA的不同組合所誘導(dǎo)。除Ⅲ型愈傷組織在繼續(xù)培養(yǎng)中逐漸褐化死亡外，其它兩種愈傷組織均能不斷地繼代、增殖；Ⅰ型愈傷組織在添加6-BA和NAA5種不同濃度組合的分化培養(yǎng)基上都有不同程度的芽分化，以在3.0mg/L6-BA+0.15mg/LNAA的培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)率最高(85.0％)；但Ⅱ型愈傷組織在分化培養(yǎng)基上均未成功誘導(dǎo)出芽；

7、 3.克隆了白姜花ACC氧化酶基因(ACO)的cDNA片斷。以白姜花衰老期花瓣總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)已報(bào)道的多種植物ACC氧化酶的氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，經(jīng)兩次PCR擴(kuò)增得到一條PCR產(chǎn)物帶，對(duì)序列測(cè)定結(jié)果與已發(fā)表的其它植物ACO基因的cDNA序列進(jìn)行對(duì)比分析顯示，該片斷大小為323bp，與香蕉(AF081917)、甘蔗(AY521566)、月季(AF441282)ACO基因CDS的同源性分別達(dá)98％、