鴨梨多酚氧化酶基因克隆及其反義轉化的研究.pdf

1、在梨果實生產和加工過程中，多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)的大量存在引發(fā)了果實的迅速褐變，給果品的外觀品質和加工性能帶來了嚴重的影響，已經成為困擾我國梨果品生產和經營的主要難題之一，生產上急需對其進行性狀改良。本研究以降低原產我國梨品種——鴨梨果實組織內多酚氧化酶含量為目標，圍繞著多酚氧化酶基因開展了基因克隆、序列分析、反義表達載體構建以及遺傳轉化等一系列研究，最終獲得了低多酚氧化酶活性的轉基因鴨梨植株，從而為

2、從根本上解決梨果實褐變問題、培育抗褐變梨新品種奠定了基礎。所取得的主要成果如下所示：
　　 1.根據多酚氧化酶基因保守序列設計一對引物，以鴨梨果實cDNA為模板擴增得到1782bp的鴨梨多酚氧化酶基因cDNA片段，并以此序列為基礎RACE擴增該基因cDNA全長，得到了長度的2126bp的鴨梨多酚氧化酶基因cDNA全長序列，進一步根據得到的cDNA序列開放性讀碼框設計引物擴增得到鴨梨多酚氧化酶基因DNA序列，結果顯示該基因cDNA

3、序列和DNA序列堿基組成無差異，證實鴨梨多酚氧化酶基因組成上不具備內含子。
　　 2.對鴨梨多酚氧化酶基因所翻譯氨基酸序列進行生物信息學分析，結果表明該氨基酸序列與其它物種多酚氧化酶高度同源，且包含一個由210個氨基酸殘基組成的酪氨酸酶超級家族保守結構域，具有一個酪氨酸酶CuA結合位點和一個酪氨酸CuB結合位點，證實鴨梨多酚氧化酶屬酪氨酸酶超級家族成員，該酶在發(fā)揮酶促作用時需要Cu2+作為輔因子。
　　 3.基于所獲得的

4、氨基酸序列對鴨梨多酚氧化酶進行蛋白空間結構預測，結果顯示鴨梨多酚氧化酶應屬于全α-結構的珠蛋白型α-螺旋蛋白；該蛋白的疏水性氨基酸位于分子內部，親水性氨基酸位于分子表面，具有可溶性親水蛋白的典型特征，不具備跨膜結構，故推測鴨梨多酚氧化酶在細胞中的定位應該位于類囊體腔中。
　　 4.首次構建了鴨梨葉片再生體系，確定鴨梨最佳葉片愈傷組織誘導培養(yǎng)基為NN69+BA3.0mg/L+IAA0.5mg/L，再生頻率和再生芽數分別為80％和1

5、.77；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L，增殖系數可達2.23；最佳繼代培養(yǎng)基為MS+BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L，平均苗高4.98cm；最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L，生根率和平均根數分別為50％和2.04。
　　 5.首次構建了鴨梨多酚氧化酶基因的反義表達載體。根據所克隆到的鴨梨多酚氧化酶基因序列，選擇3’端450bp序列片段，與切除Gus基因的

6、真核表達載體pBI121反向連接后，電轉儀法轉化農桿菌EHA105，經酶切和PCR鑒定證實，鴨梨多酚氧化酶基因反義表達載體構建成功，并已整合到農桿菌上。
　　 6.首次優(yōu)化建立了鴨梨的遺傳轉化體系。在鴨梨葉片再生體系的基礎上對影響農桿菌介導遺傳轉化的各方面因素進行優(yōu)化，結果顯示，當葉盤預培養(yǎng)2天，農桿菌菌液濃度OD600=0.4、侵染5min、共培養(yǎng)2天時出愈率和轉化率最高，而愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加400μg/ml的羧芐青霉素