茶樹多酚氧化酶的基因克隆與原核表達(dá).pdf

1、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO，EC．1.10.3.1）對(duì)茶葉品質(zhì)的形成起關(guān)鍵作用，尤其與紅茶品質(zhì)的形成更是密切相關(guān)。茶樹PPO除可應(yīng)用于提高紅茶品質(zhì)外，還可應(yīng)用于制備茶黃素及酚類廢水治理等方面的研究。本課題選用國家級(jí)茶樹良種宜紅早和地方優(yōu)良茶樹品種安徽一號(hào)為材料，以鮮葉基因組DNA為模板，克隆了茶樹PPO基因，并進(jìn)行原核表達(dá)，最終獲得了具有生物活性的茶樹PPO工程蛋白，為應(yīng)用于紅茶加工以及茶黃素生物制劑的研發(fā)

2、等方面提供了理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
　　 （1）茶樹多酚氧化酶的基因克隆與生物信息學(xué)分析
　　 直接以宜紅早和安徽一號(hào)的基因組DNA為模板，擴(kuò)增PPO基因，將獲得的PPO基因測序，并對(duì)其基因和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明安徽一號(hào)和宜紅早的PPO基因序列與GenBank中已公布的其它茶樹品種的PPO基因高度同源，尤其是在銅離子結(jié)合部位。茶樹PPO為細(xì)胞質(zhì)中合成的親水性不穩(wěn)定蛋白，不存在跨膜螺旋，沒有信號(hào)肽，但

3、是含有葉綠體轉(zhuǎn)移肽，協(xié)助PPO定位于葉綠體中。在此基礎(chǔ)上，對(duì)PPO蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并成功構(gòu)建了其三維結(jié)構(gòu)模型。所獲得的基因序列已在GenBank中登陸注冊，登陸號(hào)為EU787433（宜紅早1800bp）、FJ210643（安徽一號(hào)1800 bp）、FJ210644（安徽一號(hào)1799 bp）、FJ210645（安徽一號(hào)1803 bp）。
　　 （2）茶樹多酚氧化酶的原核表達(dá)與酶活力測定
　　 嘗試了pET20bn

4、、pET28a、pET32a和pET20b四種蛋白表達(dá)載體表達(dá)茶樹PPO，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)載體的種類與PPO的表達(dá)量有明顯的相關(guān)性。以pET28a和pET20b為載體不表達(dá)；pET20bn雖能表達(dá)PPO，但表達(dá)量偏低；以pET32a為表達(dá)載體，PPO能大量表達(dá)，盡管極易形成包涵體，但依然有小量可溶性蛋白。因此，最終選擇pET32a作為茶樹PPO的表達(dá)載體?？赡苡捎诎不找惶?hào)PPO基因在擴(kuò)增過程中產(chǎn)生了突變，致使其在大腸桿菌中沒能表達(dá)，因此我們

5、在本試驗(yàn)中只對(duì)宜紅早PPO基因大量表達(dá)，以鎳離子親和柱純化可溶性的部分，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)除目的蛋白外，還含有較明顯的兩條雜蛋白。將所得PPO工程蛋白進(jìn)行酶活性檢測，活力可達(dá)20.867U。
　　 （3）茶樹多酚氧化酶亞蛋白的原核表達(dá)
　　 以純化的安徽一號(hào)（FJ210643）和宜紅早（EU787433）PPO基因?yàn)槟０?，?duì)PPO亞蛋白的基因序列進(jìn)行了擴(kuò)增，分別為PPO-1532bp和PPO-1053bp。

6、原核表達(dá)SDS-PAGE電泳檢測的結(jié)果表明，與PPO全長基因相比，亞蛋白基因更容易在大腸桿菌中表達(dá)，說明導(dǎo)肽對(duì)蛋白表達(dá)量有顯著影響。對(duì)PPO亞蛋白粗酶液酶活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)切去導(dǎo)肽后的亞蛋白粗酶液活性高于全長蛋白粗酶液，因此可用于大量純化和制備PPO亞蛋白。
　　 （4）茶樹多酚氧化酶包涵體的變性與復(fù)性
　　 大量表達(dá)獲得宜紅早PPO、宜紅早PPO-1532和安徽一號(hào)PPO-1532的包涵體蛋白，采取變性后超濾復(fù)性，SD