酚氧化酶原(proPO)編碼基因的原核表達及其體內表達水平研究.pdf

1、酚氧化酶(phenoloxidase，簡稱PO，EC.1.14.18.1)在昆蟲的生理發(fā)育和內源性免疫過程中具有重要功能，如黑化或包被入侵的病原物、昆蟲傷口的愈合等。目前對酚氧化酶酶原(proPO)的激活途徑進行了很多研究，但對激活的整個過程和機制仍不太清楚;有研究表明鱗翅目昆蟲的proPO主要產生于血淋巴的類絳色細胞，但其進化和形成過程尚不十分明確。為了進一步研究昆蟲proPO的性質與功能，探討其在昆蟲生長發(fā)育過程中的作用，本文采用鱗

2、翅目害蟲小菜蛾（Plutella xylostella）和菜青蟲（Pieris rapae）為研究對象，采用RT-PCR技術克隆得到了編碼小菜蛾PxPPO1和PxPPO2基因的全長編碼區(qū)序列，并將該片段與表達載體pET-30a連接構建重組表達質粒，轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞后由IPTG誘導表達，獲得融合蛋白。另外，本文采用球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的成熟孢子侵染菜青蟲4齡幼蟲，并通過實時熒光定量PCR(Q

3、uantitative Real-time PCR)分析了侵染不同時間后PPO1在菜青蟲體內的表達情況;收集不同發(fā)育時期菜青蟲血淋巴，統(tǒng)計其類絳色細胞的數(shù)量，研究不同發(fā)育時期類絳色細胞密度與PrPPO1表達量之間的關系。主要內容如下:
　　1.將克隆到的PxPPO1的ORF片段插入到pET-30a原核表達載體中，構建了長度為7451 bp的重組質粒pET-30a-PxPPO1，在大腸桿菌系統(tǒng)中誘導表達，得到83 kDa(PxPPO

4、178.56 kDa，His-tag4.66 kDa)的目標蛋白，該目標蛋白的表達量占總細胞的50％以上，超聲破碎后分析，常規(guī)條件下誘導表達的蛋白以包涵體的形式存在。
　　2.將克隆得到的PxPPO2的ORF片段插入到pET-30a原核表達載體中，構建了長度為7480 bp的重組質粒pET-30a-PxPPO2，在大腸桿菌系統(tǒng)中誘導表達，得到84.5kDa(PxPPO279.86 kDa，His-tag4.66 kDa)的目標蛋白

5、，該目標蛋白的表達量占總細胞的50％以上，超聲破碎后分析，常規(guī)條件下誘導表達的蛋白以包涵體的形式存在。
　　3.優(yōu)化誘導表達條件的結果表明，PxPPO1經(jīng)不同濃度的IPTG誘導產生融合蛋白的表達量均占細菌總蛋白表達量的60％以上，不同濃度對蛋白表達量的影響不明顯;PxPPO1在同樣條件下誘導不同時間，3h后，融合蛋白的表達量占細菌總蛋白表達量的32％，8h后，達到總蛋白的62％;不同溫度下誘導PxPPO1，30℃融合蛋白有較高的表

6、達，約占細菌總蛋白表達量的84％;在15℃誘導該比例達到73％。
　　4.PxPPO2經(jīng)不同濃度的IPTG誘導產生融合蛋白的表達量均占細菌總蛋白表達量的62％以上，不同濃度對蛋白表達量的影響不明顯;PxPPO2在同樣條件下誘導不同時間，3h后，融合蛋白的表達量僅占細菌總蛋白表達量的27％;6 h后，所占比例明顯上升，達到40％，誘導8h后，達到58％;不同溫度下誘導PxPPO2，在15℃、20℃、25℃和30℃培養(yǎng)條件下誘導的蛋白

7、占菌體總蛋白的比例分別為60％、83.8％、86.6％和88.1％。
　　5.經(jīng)western印跡鑒定，誘導表達的融合蛋白為試驗所需要的目標蛋白。這為下一步制備PxPPO1和PxPPO2多克隆抗體，對PxPPO基因進行蛋白水平的分析和研究該酶的功能奠定了基礎，為酚氧化酶調控昆蟲生長發(fā)育及免疫反應的研究提供了新思路。
　　6.球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的成熟孢子侵染菜青蟲4齡幼蟲試驗表明，侵染6 h-1

8、2 h，PrPPO1的表達量顯著降低，在6h和12h的表達量分別為對照的0.59倍和0.18倍。然而在侵染后72 h PrPPO1的表達量大幅提高，約為對照表達量的9.00倍。在侵染后2h（1.12倍）、24 h(0.33倍)、48 h（1.06倍）PrPPO1的表達水平與對照相比沒有顯著性差異。
　　7.統(tǒng)計了不同發(fā)育時期菜青蟲血淋巴中類絳色細胞的數(shù)量，菜青蟲4齡幼蟲類絳色細胞密度為20.44×104個/mL，相對其他齡期密度最