紅褐斑腿蝗免疫動態(tài)研究及其酚氧化酶基因克隆、序列分析和組織表達.pdf

1、本文以紅褐斑腿蝗Diabolocatantops pinguis為研究對象，通過包囊黑化能力分析、血淋巴酚氧化酶（PO）和溶菌酶活性測定等手段，對不同發(fā)育階段、不同溫度處理下、不同季節(jié)及繁殖期間的紅褐斑腿蝗免疫活性進行了研究；并利用RT-PCR法克隆了紅褐斑腿蝗酚氧化酶基因PPO1和PPO2，對PPO2進行了序列分析，還通過RT-PCR法對PPO1和PPO2在紅褐斑腿蝗11種組織中的分布進行了研究。研究結(jié)果如下：
　　1.不同齡期

2、紅褐斑腿蝗PO活性隨齡期的增長而增高，溶菌酶活性變化差異不大，1至4齡血淋巴蛋白含量變化差異不顯著，且明顯高于5齡和成蟲。結(jié)果顯示其免疫能力也隨齡期增加而增強。
　　2.研究了不同溫度處理及不同季節(jié)紅褐斑腿蝗的免疫活性變化，實驗結(jié)果表明：為12月、1月和2月即冬季免疫活性最低；夏末（7月及8月）免疫活性也較低；而春季（3月、4月及5月）、初夏（6月）和秋季（9月、10月及11月）免疫活性很高。且交配時期免疫活性有性別差異，表現(xiàn)為雌

3、性高于雄性。不同溫度處理下，光照、濕度及營養(yǎng)水平統(tǒng)一，其免疫活性變化規(guī)律表明該蝗蟲在25℃時整體免疫活性最高。
　　3.研究了紅褐斑腿蝗繁殖期間免疫活性變化，結(jié)果表明：雄性在免疫與繁殖之間存在權(quán)衡，其免疫活性隨交配次數(shù)增加而降低；雌蝗酚氧化酶在卵巢發(fā)育初期活性提高，但其后酚氧化酶活性隨卵巢進一步發(fā)育反而下降，而當卵巢發(fā)育到 V級時，酚氧化酶活性又迅速提高。溶菌酶活性具有類似的變化趨勢。
　　4.酚氧化酶是昆蟲體液免疫中一個重

4、要的免疫因子，通過 RT-PCR技術(shù)，克隆了紅褐斑腿蝗酚氧化酶基因PPO2的全長cDNA和PPO1的大部分片段。PPO2基因（FJ598046） cDNA長度為2445bp，開放閱讀框為2076bp，編碼691個氨基酸殘基。預(yù)測PPO2基因編碼蛋白質(zhì)的等電點（pI）和分子量（Mw）分別為：10.25和79.465KDa。紅褐斑腿蝗與東亞飛蝗Locusta migratoria、野桑蠶 Bombyx mandarina及家蠶Bombyx

5、mori等昆蟲PPO2基因都具有相似的2個高度保守的銅離子結(jié)合位點，位點內(nèi)包含6個保守的組氨酸殘基。采用BLASTP同源序列搜索結(jié)果表明，紅褐斑腿蝗PPO2與其它真核生物的PPO2有著較高的同源性（60％-92%）。將紅褐斑腿蝗與昆蟲其它13個物種的PPO氨基酸序列進行多序列比對分析結(jié)果顯示：昆蟲中，PPO2或PPO1基因的同源性很低，而相同基因不同物種之間的同源性較高，與PPO1的同源性較低。不論PPO2還是PPO1基因，紅褐斑腿蝗與