合浦珠母貝3個(gè)抗氧化酶基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、合浦珠母貝(Pinctadafucata)又稱馬氏珠母貝，是中國及世界上海水珍珠培育的主要種類之一，我國廣東、廣西和海南沿海一帶合浦珠母貝所產(chǎn)珍珠即為舉世聞名的“南珠”。海水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)是我國華南沿海的特色經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一。近年來，養(yǎng)殖合浦珠母貝出現(xiàn)了死亡率升高的現(xiàn)象，造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失，成為制約海水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的技術(shù)瓶頸之一。合浦珠母貝不同于脊椎動(dòng)物，只有先天性免疫系統(tǒng)，目前對(duì)其免疫防御機(jī)制也缺乏了解，因此深入開展合浦珠母

2、貝免疫機(jī)制研究并在此基礎(chǔ)上尋找珍珠貝疾病防治的有效方法已成為當(dāng)務(wù)之急。
　　 本論文從合浦珠母貝體內(nèi)克隆了含硒型谷胱甘肽過氧化物還原酶(Se-glutathioneperoxidase,poSe-GPx)、omega型谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-transferases,poGSTO)和過氧化物還原酶(Peroxiredoxin,poPrx)等3個(gè)與免疫系統(tǒng)相關(guān)的抗氧化酶基因，分析了它們的分子結(jié)構(gòu)特征，組織分布及應(yīng)

3、答不同病原刺激的表達(dá)變化模式，并對(duì)其中的poGSTO和poPrx基因進(jìn)行了體外重組表達(dá)和SDS-PAGE鑒定，以期對(duì)其功能進(jìn)行初步探討。
　　 谷胱甘肽過氧化物還原酶(GPx)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是細(xì)胞解毒機(jī)制中兩種重要的酶類，可以保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的破壞。本文研究了合浦珠母貝含硒型谷胱甘肽過氧化物還原酶基因結(jié)構(gòu)特征和在應(yīng)激狀態(tài)下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，合浦珠母貝含硒型谷胱甘肽過氧化物還原酶(poSe-GPx)cDNA全長(zhǎng)為1

4、271bp,5’-非編碼區(qū)(Untranslatedregion，UTR)長(zhǎng)28bp,3’-UTR長(zhǎng)631bp，包括4個(gè)RNA不穩(wěn)定信號(hào)結(jié)構(gòu)域（ATTTA）、一個(gè)保守的硒代半胱氨酸插入序列(Selenocysteineinsertionsequence,SECIS)和一個(gè)位于poly(A)尾巴上游22個(gè)核苷酸處的多聚腺苷信號(hào)(AATAAA)。開放閱讀框（Openreadingframe,ORF）為612bp，編碼由203個(gè)氨基酸組成的多

5、肽，分子量約23.1kDa，理論等電點(diǎn)為8.29。PoSe-GPx第51個(gè)氨基酸為硒代半胱氨酸(Sec)，由密碼子TGA編碼。PoSe-GPx序列中存在一個(gè)保守的GPx簽名序列75LGFPCNQF82，一個(gè)活性位點(diǎn)序列162WNFEKF167和一個(gè)糖基化位點(diǎn)87NCT89。利用MatGAT軟件對(duì)poSe-GPx氨基酸序列和其它物種GPx序列進(jìn)行同源性和相似性分析，結(jié)果表明poSe-GPx與其它物種GPx序列具有較高的保守性，同源性為42

6、％-55％，相似性為56％-71％。組織表達(dá)模式分析表明poSe-GPxmRNA在消化腺、鰓、性腺、血細(xì)胞、閉殼肌、腸和外套膜中都有表達(dá)。免疫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在2h和4h時(shí)poSe-GPx基因在消化腺中的表達(dá)顯著上調(diào)，表明poSe-GPx可能參與了合浦珠母貝的先天免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一個(gè)多功能的Ⅱ相代謝酶家族，主要催化還原性谷胱甘肽與親電子物質(zhì)結(jié)合，使其失去DNA結(jié)合活性，然后以無毒物質(zhì)形式排

7、出體外。研究分析了合浦珠母貝omega型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因(poGSTO)結(jié)構(gòu)特征和在應(yīng)激狀態(tài)下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。PoGSTOcDNA序列全長(zhǎng)為1714bp,其中5’-UTR為110bp,3’-UTR為881bp,ORF為723bp，可編碼240個(gè)氨基酸，分子量大約為28kDa，等電點(diǎn)為8.52。序列分析顯示，在3’-UTR區(qū)有一個(gè)典型的polyA加尾信號(hào)AATAAA，位于polyA上游31bp處。氨基酸序列含有保守的N-端結(jié)構(gòu)域(1

8、8Gly-Lys96)、C-端結(jié)構(gòu)域(101Asp-Tvr237)和保守的半胱氨酸活性位點(diǎn)Cys14。預(yù)測(cè)的氨基酸序列不含信號(hào)肽，說明該蛋白可能為胞內(nèi)蛋白。利用MatGAT軟件對(duì)poGSTO氨基酸序列和其它物種omega-GST序列進(jìn)行同源性和相似性分析，結(jié)果表明poGSTO與其它物種omega-GST序列具有較高的保守性，同源性為36.3％-51.3％，相似性為54.6％-69.6％。構(gòu)建進(jìn)化樹結(jié)果，顯示poGSTO與其他物種的ome

9、ga-GST聚類到一起。組織表達(dá)模式分析表明poGSTOmRNA在消化腺、鰓、性腺、血細(xì)胞、閉殼肌、腸和外套膜中都有表達(dá)。免疫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，poGSTO基因在消化腺中的應(yīng)激表達(dá)規(guī)律體現(xiàn)了其活性可能與合浦珠母貝免疫功能有關(guān)。將該基因定向克隆到原核表達(dá)載體pRSET中，在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)出帶His-tag的融合蛋白，分子量約為32kDa，大小與預(yù)期一致。
　　 通過3'RACE獲得的合浦珠母貝過氧化物還原酶(poPrx

10、),cDNA序列全長(zhǎng)為1843bp，其中5’-UTR為27bp,3’-UTR為1216bp,ORF為600bp，可編碼199個(gè)氨基酸，分子量大約為22.3kDa，等電點(diǎn)為7.75。序列分析顯示，在3’-UTR區(qū)有一個(gè)典型的polyA加尾信號(hào)AATAAA，位于polyA上游37bp處。SignalP軟件預(yù)測(cè)氨基酸序列不含信號(hào)肽，說明該蛋白可能為胞內(nèi)蛋白。序列中含有保守的Prx家族特征序列42FYPMDFTFVCPTEI55和169GEVC

11、PA174。利用MatGAT軟件對(duì)poPrx氨基酸序列和其它物種Prx序列進(jìn)行同源性和相似性分析，結(jié)果表明poPrx與其它物種Prx序列具有較高的保守性，同源性為52.0％-78.5％，相似性為60.9％-89.9％。構(gòu)建進(jìn)化樹結(jié)果，顯示poPrx與其他物種的Prx4聚類到一起。組織表達(dá)模式分析表明poPrxmRNA在消化腺、鰓、性腺、血細(xì)胞、閉殼肌、腸和外套膜中都有表達(dá)。免疫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，poPrx基因在消化腺和鰓中的應(yīng)激表達(dá)規(guī)律