ACC合酶反義基因轉(zhuǎn)化洋桔梗‘Double Mariachi Pink’的研究.pdf

1、洋桔梗是目前國(guó)際上十分流行的切花之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值。然而洋桔梗切花對(duì)乙烯較敏感，較易衰敗。乙烯是一種植物衰老激素，ACC合酶是其生物合成途徑中的限速酶。為了抑制乙烯的生物合成，從而延緩其切花衰老，本研究以洋桔梗(Eustoma grandiflorum)’Double Mariachi Pink’品種為試驗(yàn)材料，優(yōu)化了高效穩(wěn)定的洋桔梗遺傳轉(zhuǎn)化體系，并利用反義RNA技術(shù)將桃ACC合酶(ACS)反義基因片段(1008bp)通

2、過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化洋桔梗，以期延長(zhǎng)其切花的瓶插時(shí)間。 首先，本研究?jī)?yōu)化了洋桔梗葉片遺傳轉(zhuǎn)化的篩選體系。通過(guò)研究羧芐青霉素(Cb)對(duì)根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404生長(zhǎng)、洋桔梗葉片不定芽分化的影響，確定了脫菌培養(yǎng)基中用200mg/L的Cb來(lái)抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)：通過(guò)研究卡那霉素(Kin)對(duì)洋桔梗葉片分化、不定芽生長(zhǎng)和生根的影響，確定了不定芽分化的Km篩選濃度為30mg/L，壯苗階段的Km篩選濃度為30mg/L，生根階段的Km篩選濃度為15

3、mg/L。 然后，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將桃ACC合酶反義基因片段轉(zhuǎn)化洋桔梗，其中該ACS反義基因片段長(zhǎng)1008bp，為全長(zhǎng)基因(2496bp)外顯子的一部分(1489～2496bp)，在實(shí)驗(yàn)室原有基礎(chǔ)上進(jìn)行了轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。根據(jù)GUS瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)、不定芽誘導(dǎo)率及篩選兩個(gè)月后的抗性苗數(shù)量等結(jié)果，確定優(yōu)化后的條件為：經(jīng)預(yù)培養(yǎng)3d的洋桔梗葉片，用農(nóng)桿菌重懸液濃度為OD600≈0.5的重懸液浸泡10min，再于24℃黑暗條件下共培養(yǎng)5d，然后

4、轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)。 最后，對(duì)抗性再生植株進(jìn)行了檢測(cè)。116株再生抗性苗經(jīng)選擇生根培養(yǎng)，有55株生根，生根率為47.4％；對(duì)8株生根抗性苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，有4株有GUS基因表達(dá)；PCR擴(kuò)增上述8株生根抗性苗，有5株呈陽(yáng)性，其中4株為GUS基因表達(dá)株；對(duì)該5個(gè)PCR.陽(yáng)性株系進(jìn)行PCR-Southern雜交，最終得到1株轉(zhuǎn)化株系。 另外，本研究還利用正交設(shè)計(jì)建立了洋桔梗的RAPD最佳反應(yīng)體系，即在25 μL反

5、應(yīng)體積中，10×PCR buffer為2.5μL，Mg2+濃度為2.0mmol/L，dNTPs濃度為0.4mmol/L，引物濃度為0.2μmol/L，模板用量為50ng，Taq DNA聚合酶用量為1.0 U，退火溫度經(jīng)篩選選定為41℃：并利用該體系對(duì)5株洋桔梗轉(zhuǎn)化植株(PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，盡管所選的4個(gè)引物擴(kuò)增出的洋桔梗轉(zhuǎn)化再生植株與非轉(zhuǎn)化植株(對(duì)照)PCR產(chǎn)物帶型未顯示出差異，但是進(jìn)一步證明了該體系具有較好的穩(wěn)定