花生PEPCase基因反義表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化高效基因型的篩選.pdf

1、花生是世界四大油料作物之一，也是我國單產(chǎn)、總產(chǎn)和出口創(chuàng)匯最高的油料作物。提高花生籽仁含油量是花生育種的重要目標(biāo)之一。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)可根據(jù)育種目標(biāo)有針對(duì)性地轉(zhuǎn)移單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因，避免了大量不良基因的干擾，所需的群體小，周期短，比常規(guī)育種更有效。生物技術(shù)的發(fā)展，為利用基因工程提高花生含油量的育種工作奠定了基礎(chǔ)。反義RNA技術(shù)是利用人工合成的一段DNA(或cDNA)，反向與啟動(dòng)子連接，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成反義RNA，反義RNA與受體細(xì)胞

2、靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA分子堿基互補(bǔ)，形成復(fù)合體，抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。植物油脂、蛋白質(zhì)合成途徑中糖酵解產(chǎn)物-磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)可作為油脂、蛋白質(zhì)生物合成的共同底物，PEPCase(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)是油脂合成途徑中一個(gè)潛在關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)。利用反義RNA技術(shù)，抑制花生籽仁中PEPCase基因表達(dá)，降低PEPCase量，減少進(jìn)入蛋白質(zhì)合成途徑的PEP量，使更多PEP流向脂肪酸的合成途徑，為油脂合成提供更多底物，可有效提高花生籽仁含油量。

3、 本研究利用同源克隆技術(shù)獲得花生PEPCase基因的cDNA片段，將目的片段與花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S)反向連接，構(gòu)建反義表達(dá)載體；用含有質(zhì)粒pGBVE(攜帶)γ-維生素E甲基轉(zhuǎn)移酶基因(γ，-tmt)和篩選標(biāo)記基因bar)的根癌農(nóng)桿菌GV3101侵染預(yù)培養(yǎng)4d的花生胚小葉，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，分析17個(gè)花生栽培品種(11個(gè)大花生品種和6個(gè)小花生品種)的植株再生率和基因轉(zhuǎn)化效率，篩選遺傳轉(zhuǎn)化率較高的品種。利用PCR技

4、術(shù)檢測(cè)抗PPT轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的整合情況。主要研究結(jié)果如下： 1.花生PEPCase基因cDNA片段克隆及其反義表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank上發(fā)表的花生PEPCase基因序列(EU391629)設(shè)計(jì)引花生PEPCase基因反義表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化高效基因型的篩選物，用荔蒲大花生cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增PEPCase基因片段，瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴(kuò)增的目的片段，并與克隆載體pGM-Teasy連接，獲

5、得重組質(zhì)粒pGMPEP，序列分析表明，獲得的PEPCase基因序列長886bp，與GenBank發(fā)表的PEPCase基因序列的同源性為99.77％，氨基酸序列同源性100％。重組子pGMPEP和質(zhì)粒pBI121分別用BamHI和SacI雙酶切，并回收PEPCase基因片段和切除GUS基因的pBI121載體DNA，反向目的基因片段與回收載體連接，構(gòu)建成PEPCase基因的反義表達(dá)載體pBGPEP。 2.花生遺傳轉(zhuǎn)化高效基因型的篩選

6、 不同基因型之間的分化率、再生率和轉(zhuǎn)化率差異顯著。農(nóng)桿菌侵染后分化率較高的品種有：豐花2號(hào)、05A110、花選9號(hào)、臨花5號(hào)和莒南2號(hào)，分化率分別是28.43％、18.40％、14.48、12.07％和10.52％；再生率較高的品種有：豐花2號(hào)、05A110、臨花5號(hào)、花選9號(hào)和莒南2號(hào)，再生率分別是67.57％、32.93％、24.77％、21.41％和21.21％?；蜣D(zhuǎn)化率較高的品種是：莒南2號(hào)、臨花5號(hào)、HY-1和豐花2