杉木木材形成過程中差異表達(dá)基因的鑒定與功能分析.pdf

1、木材是自然界最為重要的可再生能源，是化石燃料的潛在替代品。同時(shí)還具有重要的生態(tài)價(jià)值，它是大氣碳元素長(zhǎng)期的沉淀池，是實(shí)現(xiàn)生物圈各種物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 木材是需求快速增長(zhǎng)的全球性的重要工業(yè)原材料。它是林木的主要產(chǎn)品。正因?yàn)槟颈局参镏匾慕?jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，植物學(xué)家已經(jīng)開始致力于該方面的研究。木材形成是一個(gè)關(guān)鍵的發(fā)育過程，具有重要的科學(xué)研究意義與應(yīng)用價(jià)值。它起源于一個(gè)高度特化的組織——維管形成層，包括以下5個(gè)步驟：細(xì)胞分裂、細(xì)胞增大、

2、細(xì)胞壁加厚、木質(zhì)化及細(xì)胞程序性死亡。 隨著各種新的基因組技術(shù)在林木研究中的應(yīng)用，以及模式植物中不斷完善的進(jìn)化上保守的機(jī)制，對(duì)木材形成的分子和遺傳調(diào)控機(jī)理已有了較廣泛的認(rèn)識(shí)。但是，這仍然是十分有限的。大部分關(guān)于木材形成的研究進(jìn)展是對(duì)形成木材的組織進(jìn)行EST測(cè)序分析、蛋白質(zhì)組學(xué)分析以及芯片分析。 一杉木木材形成差異表達(dá)基因文庫(kù)的構(gòu)建和分析為了獲得杉木木材形成過程中特異表達(dá)基因，本研究利用抑制差減雜交技術(shù)，以杉木突變體獨(dú)干

3、杉無性系為測(cè)試方(Tester)，正常的句容0號(hào)無性系為驅(qū)動(dòng)方(Driver)，構(gòu)建了正向差減文庫(kù)；以杉木突變體獨(dú)干杉無性系為驅(qū)動(dòng)方(Driver)，正常的句容0號(hào)無性系為測(cè)試方(Tester)，構(gòu)建了反向差減文庫(kù)。利用macroarray技術(shù)，以正向差減、反向差減及未差減的測(cè)試方(Tester)、驅(qū)動(dòng)方(Driver)四種探針，進(jìn)一步篩選了差異表達(dá)克隆，從正、反向文庫(kù)中分別獲得了618和409個(gè)克隆。 序列測(cè)定及分析后，共獲

4、得405個(gè)uniESTs。其中40％的與已知蛋白具有顯著同源性，可分為4個(gè)主要類別：新陳代謝、細(xì)胞生成和結(jié)構(gòu)重構(gòu)、信號(hào)傳導(dǎo)和脅迫。定量PCR對(duì)選擇的11個(gè)參與木材形成的ESTs進(jìn)一步的驗(yàn)證，結(jié)果與macroarray數(shù)據(jù)一致。 本研究系統(tǒng)分析了參與杉木木材形成的基因，對(duì)了解木質(zhì)部分化的分子機(jī)制具有重要意義，也是了解木材形成遺傳控制的直接信息來源，為改良材性和纖維性質(zhì)提供了潛在候選基因。 二細(xì)胞壁擴(kuò)展相關(guān)基因的克隆和功

5、能分析細(xì)胞壁蛋白在調(diào)控細(xì)胞壁延展性中起重要作用，而細(xì)胞壁的延展性是決定細(xì)胞擴(kuò)展的關(guān)鍵因子。在這些壁蛋白中擴(kuò)展蛋白(expansins)最為獨(dú)特，它在一定的pH值下無需任何激活蛋白就能誘導(dǎo)體外細(xì)胞壁的伸長(zhǎng)和體內(nèi)細(xì)胞的擴(kuò)展。 以杉木木材形成的特異表達(dá)基因文庫(kù)中獲得的擴(kuò)展蛋白ESTs序列為基礎(chǔ)，通過RLM-RACE技術(shù)成功克隆到3條全長(zhǎng)擴(kuò)展蛋白基因。其中ClEXP1 eDNA全長(zhǎng)1033bp，包括247個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF)

6、區(qū)；ClEXP2 cDNA全長(zhǎng)1374bp，包括268個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF)區(qū)； ClELP1 cDNA全長(zhǎng)1023bp，包括272個(gè)氨基酸的開放閱讀框。在GenBank中的登錄號(hào)分別為：EF102108、EF158813和EF192940。進(jìn)化樹重建結(jié)果表明，ClEXP1和ClEXP2屬于a-expansin(EXPA)；ClELP1屬于γ-expansin(EXLA)。 內(nèi)含子—外顯子結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：ClEXP1與擬

7、南芥α-expansins(EXPA)相似，含有內(nèi)含子A和B；ClEXP2含有3個(gè)內(nèi)含子(A、C和F)，與擬南芥β-expansins(EXPB)更類似。實(shí)時(shí)定量PCR顯示，ClEXP1和ClEXP2具有較為相同的表達(dá)模式，在形成層區(qū)域表達(dá)最高，在針葉及莖尖中度表達(dá)，成熟木質(zhì)部表達(dá)較低，而根和花粉中幾乎不表達(dá)；ClEXP1在形成層及針葉中均有較高的表達(dá)，在木質(zhì)部及莖尖中度表達(dá)，花粉中表達(dá)較低，而根中幾乎檢測(cè)不到。該組基因的成功克隆，將為

8、系統(tǒng)研究擴(kuò)展蛋白在木材形成過程中的表達(dá)情況、功能及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 時(shí)空表達(dá)模式表明ClEXP1和ClEXP2均在木材形成的組織形成層區(qū)域特異性表達(dá)。為了研究expansins基因在次生生長(zhǎng)中的功能，以期獲得其在木材形成過程中作用機(jī)制的生物學(xué)證據(jù)，實(shí)驗(yàn)在克隆了杉木木材形成組織特異表達(dá)ClEXP1和ClEXP2的基礎(chǔ)上，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在煙草中分別過量表達(dá)這2個(gè)基因。35S：：ClEXP1和35S：：ClEXP2轉(zhuǎn)基因煙草均呈現(xiàn)

9、多效的(pleiotropic)表型：花形、花色及蒴果均有不同程度的變化；葉片變大、且比野生型至少多2片；節(jié)間伸長(zhǎng)；高生長(zhǎng)和粗生長(zhǎng)顯著增加。與野生型煙草植株相比，35S：：ClEXP1和35S：：ClEXP2轉(zhuǎn)基因植株的纖維素含量分別增加約50％和30％。掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)：髓薄壁細(xì)胞顯著增大；木質(zhì)部及韌皮部細(xì)胞壁局部有所加厚。 總結(jié):ClEXP1和ClEXP2作為α-expansin(EXPA)基因家族的成員可能存在功能部分冗