普通煙草紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因的克隆和功能分析.pdf

1、A t h e s i ss u b m i t t e d t oZ h e n g z h o u U n i v e r s i t yf o r t h ed e g r e e o f M a s t e rC l o n i n g a n d F u n c t i o n a l A n a l y s i so f V i o l a x a n t h i nD e - e p o x i d a s e G e n

2、 e i nt h e C o m m o n T o b a c c oB y X i a o l o n g Z h o uS u p e r v i s o r ：P r o f ．J i f e n gC h e nM i c r o b i o l o g y 一一D e p a r t m e n t o f B i o e n g i n e e r i n gM a y 2 0 1 3摘要摘要本課題利用生物信息學(xué)手段分析

3、普通煙草V D E 基因的E S T ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) 序列，采用同源序列克隆的方法，從普通煙草中煙1 0 0 中克隆V D E( 按照國際慣例基因名稱采用大寫斜體) 基因序列和編碼序列；利用P C R 結(jié)合測(cè)序技術(shù)確定V D E 在煙草基因組中的拷貝數(shù)；使用熒光定量P C R 技術(shù)分析V D E在不同器官、不同品種和不同脅迫條件下的表達(dá)模式；采用蛋白純化技術(shù)在體外分析V

4、 D E 的酶活在不同溫度條件下的變化，比較不同V D E 拷貝的酶活變化；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得V D E 過表達(dá)遺傳材料，驗(yàn)證V D E 的功能。V D E 是植物類胡蘿卜素合成途徑的關(guān)鍵酶，其功能與植物色素含量、抗逆等性狀密切相關(guān)，因此V D E 的研究一直是植物領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。1 ．以煙草品種中煙1 0 0 為材料，提取葉片總R N A ，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)擬南芥( A r a b i d o p s i st h a l i a n

5、 a ) 紫黃質(zhì)脫氧環(huán)化酶( V D E ) 的氨基酸保守序列設(shè)計(jì)引物，以c D N A 第一鏈為模板，擴(kuò)增得到長(zhǎng)約1 4 3 7 b p 的兩個(gè)c D N A 片段，編碼4 7 8 個(gè)氨基酸。2 ．首先根據(jù)煙草E S T 數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的保守引物，并對(duì)P C R擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序和片段分析，確定N t V D E 基因在煙草基因組有2 個(gè)拷貝，分別命名為N t V D E J 和N t V D E 2 。3 ．進(jìn)化樹顯示

6、N t V D E l 同林煙草N s V D E 的親緣關(guān)系較近，C D S 和蛋白序列比對(duì)結(jié)果表明二者的序列相似性達(dá)到9 9 ．8 6 ％，C D S 只存在2 個(gè)S N P 的差異，蛋白僅有1 個(gè)氨基酸的不同，說明N t V D E l 可能來源于林煙草；N t V D E 2 同絨毛煙草N t o V D E 的親緣關(guān)系較近，C D S 和蛋白序列比對(duì)結(jié)果表明二者的序列相似性達(dá)到9 9 ．7 9 ％，C D S 存在3 個(gè)S N

7、 P 的差異，蛋白也僅有1 個(gè)氨基酸的不同，說明N t V D E 2 可能來源于絨毛煙草。N t V D E l 和N t V D E 2 C D S 的相似性降低到9 6 ．8 7 ％，蛋白序列相似性為9 6 ．8 6 ％，它們同番茄S l V D E 的親緣關(guān)系最近，說明茄科植物的V D E 較為保守。4 ．類胡蘿卜素通路基因表達(dá)模式分析和代謝物定性定量分析結(jié)果表明，七個(gè)類胡蘿卜素通路基因在葉片中的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)其他器官較高。此外，