甘蔗銅-鋅超氧化物歧化酶基因的克隆和功能分析.pdf

1、對(duì)于植物銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因的表達(dá)及其與抗逆脅迫關(guān)系已得到證實(shí)，但有關(guān)甘蔗Cu/Zn-SOD基因的克隆、表達(dá)抗逆脅迫中作用的研究在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。在本研究中克隆出甘蔗Cu/Zn-SOD基因，并分析其序列特征，組織表達(dá)差異，以及在不同逆境脅迫下的表達(dá)模式。構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中得到成功表達(dá);構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入野生型煙草，檢測(cè)得到煙草轉(zhuǎn)基因植株。為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能的及其

2、與逆境脅迫的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　 1、根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中與甘蔗同源性較高的禾本科植物的核苷酸序列，設(shè)計(jì)克隆該基因的上游簡(jiǎn)并引物，以甘蔗品種GT28葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，3SIDE引物為下游引物，PCR擴(kuò)增得到Cu/Zn-SOD基因的全長(zhǎng)，該序列全長(zhǎng)為710 bp，包含啟動(dòng)子ATG和終止子GGC，GenBank登陸號(hào)為JQ958328。生物信息學(xué)分析表明，Cu/Zn-SOD蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為1

3、5.1 kDa，等電點(diǎn)為5.71;其在銅鋅超氧化物歧化酶的功能區(qū)域保守型很高;進(jìn)化樹分析表明該基因的氨基酸序列與禾本科植物聚于同一進(jìn)化分支。
　　 2、根據(jù)克隆得到的Cu/Zn-SOD基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，以甘蔗品種GT28的根、莖、葉的cDNA為模板分析該基因的組織表達(dá)差異，結(jié)果表明該基因在葉片中表達(dá)量最大，莖中次之，根中很少。另外在聚乙二醇(PEG6000)、NaCl、低溫(4℃)和H2O2四種外源脅迫下，研究

4、該基因與逆境脅迫的關(guān)系，結(jié)果表明四種外源脅迫均誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，表達(dá)的模式因調(diào)控機(jī)制的不同而異，推測(cè)其與甘蔗抵御滲透脅迫相關(guān)。
　　 3、本研究構(gòu)建了Cu/Zn-SOD基因的原核表達(dá)載體，在1.0 mmol.L-1的IPTG誘導(dǎo)下，在分子量約為22.0 kDa的位置上存在1條融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條帶，與預(yù)計(jì)大小基本相符，表明該原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，無氨基酸錯(cuò)碼或移位現(xiàn)象，為今后深入研究該基因的功能及抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。