耐輻射奇球菌超氧化物歧化酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、目的：擴(kuò)增耐輻射奇球菌(Deinococcusradiodurans)錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因，構(gòu)建pET-SOD重組子，實(shí)現(xiàn)Mn-SOD在大腸桿菌中的高效表達(dá)，通過金屬離子親和層析純化表達(dá)蛋白，并對純化蛋白的性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為后續(xù)探討耐輻射奇球菌的耐輻射機(jī)制以及對SOD的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.耐輻射奇球菌錳超氧化物歧化酶基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建：用PCR方法自D.radiodurans基因組中擴(kuò)增

2、Mn-SOD目的片段。將該基因與原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET-30a(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-SOD，并轉(zhuǎn)化克隆宿主菌E.coliDH5α，利用卡那霉素抗性篩選陽性克隆，質(zhì)粒小量提取后，雙酶切和基因序列測定鑒定重組質(zhì)粒。 2.超氧化物歧化酶融合蛋白的表達(dá)及純化：重組質(zhì)粒pET-SOD轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)SOD融合蛋白表達(dá)，SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況；通過鎳金屬離子親和層析對SOD融

3、合蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE檢測蛋白純度和亞基分子量。 3.超氧化物歧化酶融合蛋白的性質(zhì)研究：包括純化產(chǎn)物總蛋白含量測定，SOD活性測定，SOD種類鑒定，SOD紫外吸收光譜測定，SOD的pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性研究。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建D.radioduransMn-SOD基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-SOD。此質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，得到表達(dá)載體片段(5.4kb)和目的基因片段(0.6-0.7kb)：經(jīng)測序，目的基

4、因全長633bp，與美國基因組研究所(TheInstituteofGenomicResearch，TIGR)數(shù)據(jù)庫以及GenBank所公布的序列相比較，存在一個堿基的差異，同源性為99％；SOD融合蛋白編碼序列全長780bp，編碼含260個氨基酸殘基的多肽鏈。 2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，含pET-SOD的表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)在29kD處有明顯的表達(dá)條帶，與核酸序列測定所推導(dǎo)預(yù)計的SOD融合蛋白分子量相符。通過鎳金屬

5、離子親和層析對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，可得到電泳純的SOD融合蛋白。 3.純化產(chǎn)物經(jīng)證實(shí)為Mn-SOD，其比活性可達(dá)19344U/mg，在280nm處有特征吸收峰，在pH5～8范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，其活性在溫度40℃～60℃范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。 結(jié)論：成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-SOD，實(shí)現(xiàn)了D.radiodurans的Mn-SOD基因在原核細(xì)胞中的高效表達(dá)，通過金屬離子親和層析可以簡便快速地得到電泳純的SOD融合蛋白，純化產(chǎn)物活