家蠶超氧化物歧化酶基因Bmsod3的克隆與原核表達.pdf

1、在氧化還原循環(huán)的過程中,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)是生物體正常氧代謝的副產(chǎn)物,其在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和保持機體正常代謝起信使作用。ROS包括:超氧陰離子自由基(O2._)、羥自由基(.OH)及過氧化氫(H2O2)等)。極端環(huán)境影響下(如暴露于紫外線或熱源下等),ROS的量便會急劇增多,會使得生物體內(nèi)的大分子都會發(fā)生不可逆的損傷,如:DNA分子結(jié)構(gòu)的損傷、脂質(zhì)氧化及酶活性結(jié)構(gòu)的不可逆損傷等一系列氧化損傷,進

2、而引起生物體的各種生理病變。過去的研究已報道了幾種對活性氧代謝平衡和生物體生存起關(guān)鍵作用的抗氧化酶。而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)就是其中的一種幾乎存在于所有的好氧生物中的關(guān)鍵抗氧化酶,也是唯一一種可以直接代謝超氧化物類活性氧的酶類。
　　經(jīng)家蠶 NPV病毒誘導(dǎo)處理的家蠶組織,我們發(fā)現(xiàn)其活性氧水平會顯著升高。篩選家蠶免疫芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)經(jīng) NPV等主要的幾種家蠶病原誘導(dǎo)后,Bmsod3基因的表達

3、水平明顯上調(diào)。預(yù)測其蛋白可能與NPV抗性有關(guān)。SOD蛋白作為第一道抗氧化酶類防線,可能有抗氧化作用?；诖?本文將首先克隆及原核表達家蠶Bmsod3基因,試圖闡明其功能,獲得結(jié)果如下:
　　1)BmSOD3作為胞外SOD蛋白,與其他昆蟲的SOD3蛋白之間有較高的序列相似性,與岡比亞按蚊(A. gambiae)達到65％。家蠶超氧化物歧化酶3(Bmsod3)基因在染色體上的唯一定位,位于8號染色體上的nscaff2828位置。Bms

4、od3基因的整個CDS長度為606bp。BmSOD3作為胞外SOD蛋白,經(jīng)預(yù)測其具有信號肽的概率為:0.843,信號肽剪接位點位于第21位氨基酸甘氨酸和22位氨基酸谷氨酸之間。預(yù)測的BmSOD3蛋白理論等電點為5.87,理論質(zhì)量為:18.96kD,加上組氨酸標(biāo)簽以后的質(zhì)量約為21kD。BmSOD3蛋白的結(jié)構(gòu)位點中的65、80、100、140位殘基為該蛋白的催化歧化反應(yīng)的活性位點;65、80、140位殘基為該蛋白的Cu2+結(jié)合位點;而80

5、、90、100位殘基為 Zn2+結(jié)合位點,其中 Cu2+、Zn2+結(jié)合位點都是相應(yīng)的催化活性中心位點所在。
　　2)利用RT-PCR方法對Bmsod3基因的組織表達情況進行了分析,發(fā)現(xiàn)其在中腸和馬氏管中特異表達,且與家蠶組織表達芯片的數(shù)據(jù)完全一致。RT-PCR分析的誘導(dǎo)表達模式發(fā)現(xiàn)在NPV誘導(dǎo)后,處理組相對于對照組的Bmsod3基因表達豐度都有所上升。
　　3)隨后我們設(shè)計全長擴增引物成功將該基因克隆到Trans-Tsimp

6、le載體上,再將克隆得到的基因重新連接表達載體上進行原核表達,在表達系統(tǒng)上我們選用了現(xiàn)在應(yīng)用較為成熟的表達菌株BL21(DE3)和表達載體pET28(a),pET28(a)上帶有方便對表達蛋白進行純化的His標(biāo)簽。對鎳柱進行蛋白純化時,當(dāng)洗脫緩沖液中咪唑濃度為300 mM時,目的蛋白開始被洗脫出來,但同時也含有比較多的雜蛋白,500mM的咪唑濃度可以很好地將目的蛋白洗脫,純化得到較單一的目的蛋白,該蛋白可用于進行蛋白透析復(fù)性,或進一步制