哈維氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表達(dá)及免疫原性的研究.pdf

1、哈維氏弧菌是一種有運(yùn)動(dòng)性,短桿的革蘭氏陰性海洋細(xì)菌,由于它有廣泛的寄主范圍,所以是日本對(duì)蝦,海參和各種魚類等海水養(yǎng)殖動(dòng)物的重要病原弧菌。在中國(guó)(包括臺(tái)灣)、泰國(guó)、印度、澳大利亞等國(guó)家和地區(qū),均有由哈哈維氏弧菌引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害流行的報(bào)道,造成了水產(chǎn)養(yǎng)殖巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 抗生素在養(yǎng)殖病害的防治方面發(fā)揮了積極的作用,但是濫用抗生素造成的藥物殘留和細(xì)菌耐藥性等不良后果,限制了其廣泛應(yīng)用。所以人們轉(zhuǎn)向利用基因工程的方法研究包括D

2、NA疫苗,活載體疫苗,基因工程亞單位疫苗等多種類型的新型疫苗,這些疫苗安全高效的優(yōu)勢(shì),在魚類病害防治方面具有很好的應(yīng)用前景。
　　 在正常代謝中細(xì)胞可以產(chǎn)生內(nèi)源性的活性氧,而且在應(yīng)答極端溫度、紫外照射、強(qiáng)光、高滲、毒素等環(huán)境壓力也會(huì)加速它的產(chǎn)生。當(dāng)ROS的產(chǎn)生和ROS清除之間的平衡機(jī)制破壞,就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激并導(dǎo)致機(jī)體損傷。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)通過催化超氧陰離子自由基(O2-)形成O2和H2O

3、2,作為一種重要抗氧化酶,是生物體防御氧毒性的第一道防線。超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于各種生物體內(nèi),根據(jù)所含金屬離子的不同,可以分為Cu,Zn-SOD、Mn-SOD,Fe-SOD。
　　 本文通過同源引物從哈維氏弧菌SF-1基因組擴(kuò)增得到了sod基因,將sod基因克隆至pMD-19T載體測(cè)序,并進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析。sod基因全長(zhǎng)600bp,含有完整的基因開放閱讀框,編碼199個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。氨基酸序列經(jīng)過Bla

4、st比對(duì),表明溶藻膠弧菌(Vibrio alginolyticus)40B、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)K5030的Fe-SOD的序列相似性高達(dá)98-99％,與霍亂弧菌(Vibrio cholerae)V52、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovii)CIP69.14、擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)VM603等Fe-SOD的序列相似性分別為91-95％。
　　 將sod基因克隆

5、于pET-26(+)表達(dá)載體,構(gòu)建的陽性質(zhì)粒在受體菌大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá),用1 mmol／L IPTG于25℃誘導(dǎo)6 h后,SOD得到了很好的表達(dá)。利用表達(dá)的融合蛋白N末端的6個(gè)組氨酸的多肽標(biāo)簽,通過鎳親和層析完成了SOD的分離純化。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明,純化的蛋白為單一條帶,分子量約為27 kDa。
　　 采用鄰苯三酚自氧化法對(duì)SOD酶活分析。酶的最適溫度為20℃,最適pH為7,是一種對(duì)熱敏感的低溫

6、酶,在10-30℃的溫度范圍內(nèi)酶活力穩(wěn)定,溫度超過40℃時(shí)酶的活力明顯喪失,60℃處理1 h后酶活力剩余為3％。酶在pH6-8時(shí)穩(wěn)定。對(duì)純化的SOD含有的金屬離子類型進(jìn)行鑒定:純化的蛋白最大吸收峰位于280 nm和362 nm,具有典型的Fe-SOD吸收光譜；對(duì)氯仿-乙醇和H2O2敏感,表明該屬于Fe-SOD。
　　 純化的重組SOD蛋白,通過肌肉注射的方式免疫大菱鲆,4周后用致病性哈維氏弧菌SF-1進(jìn)行人工感染試驗(yàn),對(duì)大菱鲆的