RIRI大鼠腦內(nèi)細胞外超氧化物歧化酶的表達變化.pdf

1、腦組織是對缺血缺氧反應(yīng)高度敏感的器官，在腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)時，腦組織是否也處于氧化應(yīng)激狀態(tài)并遭受過氧化損傷？EC-SOD的表達如何改變，在此過程中是否發(fā)揮抗氧化作用？
　　本研究首先使用無損傷血管夾夾閉腎動脈建立大鼠RIRI模型。再灌注24小時后取大鼠腦組織檢測其H2O2以及MDA的含量，再檢測EC-SODmRNA和蛋白水平發(fā)生的表達變化，并對H2O2含量、MDA含量與EC-SOD表達水平進行相關(guān)性分析。探

2、討RIRI對腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，以及在此過程中EC-SOD可能起到的抗氧化作用，為防治RIRI誘發(fā)的腦組織損傷提供一條新途徑。
　　目的:
　　觀察大鼠RIRI模型腦內(nèi)的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、H2O2含量、抗氧化酶EC-SODmRNA表達水平、EC-SOD蛋白表達水平、以及MDA含量、H2O2含量與EC-SOD表達水平的相關(guān)性，探討RIRI對腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，以及在此過程中EC-SOD可能起

3、到的抗氧化作用。
　　方法:
　　1.大鼠腎缺血再灌注損傷模型制備、分組及取材
　　12只體重200±10 g的雄性Wistar大鼠隨機分為對照組(Con)和腎缺血再灌注損傷組(RIRI)，各組6只。RIRI大鼠模型的制備:首先6％水合氯醛按5ml/kg標準進行腹腔注射，用以大鼠麻醉。然后將RIRI組大鼠切開腹壁暴露兩側(cè)腎臟，切除其右腎，然后鈍性分離左側(cè)腎動脈，于腎門處用無創(chuàng)傷動脈夾夾閉左腎動脈，隨后即可觀察到腎的顏色

4、由鮮紅逐漸變暗失去光澤轉(zhuǎn)為暗紅色。夾閉45分鐘移除動脈夾，恢復左側(cè)腎臟血液供應(yīng)，肉眼可見左側(cè)腎動脈再次充盈，顏色由暗紅色迅速恢復為鮮紅色，表明左腎血液再灌注成功。Con組大鼠切開腹壁后切除右側(cè)腎臟，于左側(cè)腎門處分離左腎動脈，但是并不夾閉。血液再灌注24小時后，再次麻醉大鼠，在大鼠右頸總動脈收插管收集大鼠血液5ml，血液3000rpm離心10min，收集血清用來檢測肌酐(Serum Creatinine，SCr)和尿素氮(BloodUre

5、a Nitrogen，BUN)的濃度;取大鼠左腎和腦，將左側(cè)腎臟置于4％多聚甲醛溶液中進行固定，采用HE染色法觀察左側(cè)腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)。腦組織置于液氮中-80度冰箱保存，用于MDA含量、H2O2含量、抗氧化酶EC-SOD mRNA表達水平、EC-SOD蛋白表達水平的測定。
　　2.觀測指標及其方法
　　2.1 血清中SCr和BUN水平的檢測
　　血清中SCr的含量用苦味酸法檢測;血清中BUN的含量用酶偶聯(lián)速率法檢測。

6、r>　　2.2 采用HE染色法觀察大鼠左腎的形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　左側(cè)腎臟經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后，用萊卡切片機切片厚約5μm，采用蘇木精伊紅染色樹膠封片后，在奧林巴斯光學顯微鏡下觀察左側(cè)腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　2.3 制備大鼠腦組織勻漿液以及測定其MDA的含量
　　將腦組織從-80℃冰箱中取出，按照10mg/100μl標準加入4度勻漿緩沖液。勻漿緩沖液包含:磷酸鉀緩沖液50mmol/L，鹽酸苯甲脒1mmol/L，PH

7、7.4, PMSF1 mmol/L, NaCl0.5mol/L,0.1％Tween-20, EDTANa31 mmol/L,5mmol/Lβ-巰基乙醇。在冰浴下腦組織勻漿2分鐘，4000rpm4℃離心勻漿液20min，取上清即為10％腦組織勻漿液。腦組織勻漿液中MDA的含量用南京建成丙二醛(MDA)含量測定試劑盒檢測。
　　2.4 制備大鼠腦組織勻漿液及測定其H2O2的含量
　　將腦組織從-80℃冰箱中取出，按照10mg/1

8、00μl標準加入4度勻漿緩沖液。勻漿緩沖液包含:磷酸鉀緩沖液50mmol/L，鹽酸苯甲脒1mmol/L，PH7.4, PMSF1 mmol/L, NaCl0.5mol/L,0.1％Tween-20, EDTANa31 mmol/L,5mmol/Lβ-巰基乙醇。在冰浴下腦組織勻漿2分鐘，4000rpm4℃離心勻漿液20min，取上清即為10％腦組織勻漿液。腦組織勻漿液中H2O2含量用鉬酸比色法檢測，過氧化氫的含量用mmol/g pro顯示

9、。
　　2.5 大鼠腦組織細胞外超氧化物歧化酶mRNA水平測定
　　用Trizol法提取大鼠腦組織的總RNA。將3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。PCR后，以GAPDH作為內(nèi)參照。將細胞外超氧化物歧化酶的擴增產(chǎn)物與內(nèi)參照進行灰度值比，其比值作為細胞外超氧化物歧化酶mRNA的相對表達量。
　　2.6 大鼠腦組織細胞外超氧化物歧化酶蛋白水平測定
　　用Western blot法測定大鼠腦組織中細胞外超氧化物歧化酶的蛋

10、白表達水平。將大鼠的腦組織制備成勻漿液，離心后取上清。采用改良Lowry法測定蛋白總量，蛋白的電泳上樣量為62 ug，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，在PVDF膜上滴加兔抗細胞外超氧化物歧化酶的一抗，室溫下靜置過夜。第二天洗膜后加入用熒光標記的抗兔IgG二抗，雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相后并進行圖像分析。
　　2.7 大鼠腦組織MDA含量、H2O2含量與EC-SOD表達水平相關(guān)性分析
　　腦組織MDA含量、H2O2含量與EC-SOD表達水

11、平雙變量間關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠腎組織形態(tài)學改變
　　奧林巴斯光學顯微鏡下顯示:Con組大鼠的腎小球、近曲及遠曲小管、集合管的形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整未見異常。RIRI組大鼠可見腎小囊腔擴張明顯;腎血管球萎縮;近曲及遠曲小管管腔也出現(xiàn)擴張，偶爾可見小管上皮細胞胞漿疏松化;腎間質(zhì)出現(xiàn)水腫，間隙擴大;集合管也呈現(xiàn)管腔擴張等改變。
　　2.血清SCr水平
　　RIRI組血清SCr濃度

12、為131.153±17.814μmol/L，Con組大鼠血清SCr濃度為103.444±8.465μmol/L，RIRI組血清SCr濃度明顯高于Con組，P＜0.05。
　　3.血清BUN水平
　　RIRI組血清BUN濃度為13.685±4.397 mmol/L，Con組大鼠血清BUN濃度為4.462±0.541 mmol/L，RIRI組血清BUN濃度明顯高于Con組，P＜0.05。
　　4.腦組織勻漿內(nèi)MDA含量

13、r>　　RIRI組腦勻漿MDA含量為11.67±2.33 mmol/g，Con組大鼠腦勻漿MDA含量為7.67±1.77mmol/g，RIRI組腦勻漿MDA含量明顯高于Con組，P＜0.01。
　　5.腦組織勻漿內(nèi)H2O2含量
　　RIRI組大鼠腦勻漿H2O2含量為30.68±3.07 mmol/g，Con組大鼠腦勻漿H2O2含量為20.41±2.36mmol/g，RIRI組大鼠腦勻漿H2O2含量明顯高于Con組，P＜0.0

14、1。
　　6.腦組織EC-SOD mRNA表達水平
　　RT-PCR法測定大鼠腦組織細胞外超氧化物歧化酶mRNA表達水平。RIRI組大鼠腦組織細胞外超氧化物歧化酶mRNA表達水平(0.94±0.12)明顯高于Con組大鼠(0.57±0.11)，P＜0.01，表明:RIRI組大鼠腦組織EC-SOD基因表達水平增強。
　　7.腦組織EC-SOD蛋白表達水平
　　Western blot法測定大鼠腦組織細胞外超氧化物歧

15、化酶蛋白表達水平。RIRI組大鼠腦組織細胞外超氧化物歧化酶蛋白表達水平(0.71±0.08)明顯高于Con組大鼠(0.49±0.08)，P＜0.01，表明:RIRI組大鼠腦組織細胞外超氧化物歧化酶蛋白表達水平升高。
　　8.腦組織MDA含量、H2O2含量與EC-SOD表達水平的相關(guān)性
　　腦組織MDA含量與EC-SOD mRNA表達水平（r=0.629，P＜0.05）、腦組織MDA含量與EC-SOD蛋白表達水平(r=0.65

16、1，P＜0.05)、腦組織H2O2含量與EC-SOD mRNA表達水平（r=0.832，P＜0.01）、腦組織H2O2含量與EC-SOD蛋白表達水平(r=0.791，P＜0.01)之間均呈正相關(guān)關(guān)系
　　結(jié)論:
　　1.RIRI可使其腦組織處于高度的氧化應(yīng)激狀態(tài)，腦組織遭受過氧化損傷。
　　2.腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，抗氧化酶EC-SOD基因和蛋白表達水平明顯增強，并與腦組織MDA含量、H2O2含量均呈正相關(guān)。表明EC