柑桔全爪螨超氧化物歧化酶基因克隆與功能初探.pdf

1、當(dāng)生物體遭受環(huán)境脅迫時，體內(nèi)會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS的累積會破壞蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)膜等大分子結(jié)構(gòu)。超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一，對于維持細(xì)胞內(nèi)的ROS平衡起著至關(guān)重要的作用。柑桔全爪螨是一種寄主范圍廣，發(fā)生持續(xù)時間長的世界性害螨，目前對該螨的防治手段主要以化學(xué)防治為主，殺螨劑長期不科學(xué)的使用使柑桔全爪螨產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的抗藥性，因此亟需從可持續(xù)及綠色的角度重新思考對該螨的防控策略。據(jù)此，為深入了解柑桔全爪螨

2、對環(huán)境脅迫的適應(yīng)機制，本學(xué)位論文對柑桔全爪螨的超氧化物歧化酶基因進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，主要結(jié)果如下：
　　1.柑桔全爪螨3個SOD基因的序列及系統(tǒng)發(fā)育分析
　　根據(jù)本課題組測序獲得的柑桔全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選目標(biāo)序列及設(shè)計引物，克隆獲得了3個SOD基因的開放閱讀框，分別命名為PcSOD1（KJ522695）、PcSOD2（KJ700412）和PcSOD3（KJ700411）。通過編碼蛋白質(zhì)的分子量、特征序列和信號肽結(jié)構(gòu)分析，

3、結(jié)果表明柑桔全爪螨PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3基因分屬于細(xì)胞質(zhì)CuZnSOD、細(xì)胞外CuZnSOD和線粒體MnSOD。氨基酸多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)，SOD1和SOD3在不同物種間的相似性高達(dá)70％，而SOD2的相似度僅為35%左右。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析結(jié)果表明所有的SOD蛋白被劃分為3個大的分支，說明柑桔全爪螨3個SOD基因在金屬結(jié)合位點、特征基序和相對分子量等方面存在差異，可能導(dǎo)致其抗氧化功能亦存在差異。
　　2.柑桔全爪

4、螨SOD基因在環(huán)境脅迫條件下的表達(dá)模式解析
　　環(huán)境脅迫能夠?qū)е律矬w內(nèi)ROS的累積，從而誘導(dǎo)SOD基因的表達(dá)上調(diào)。研究選取了重金屬、殺螨劑、紫外線（UV-B）和極端溫度4種類型的環(huán)境脅迫條件，利用實時熒光定量PCR技術(shù)對柑桔全爪螨PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3在氧化脅迫條件下的表達(dá)特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在UV-B和極端溫度（0℃和41℃）脅迫下，PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3的表達(dá)水平均顯著性上調(diào)，且上調(diào)倍

5、數(shù)較高，說明UV-B和極端溫度是導(dǎo)致柑桔全爪螨體內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷的重要環(huán)境因子。在重金屬離子（Mn2+、Cu2+和Cd2+）、0℃和UV-B處理后，PcSOD3的表達(dá)水平均顯著高于另外2個CuZnSOD基因，說明MnSOD基因是典型的誘導(dǎo)性基因，同時暗示PcSOD3可能比PcSOD1和PcSOD2具有更為重要的抗氧化功能。
　　3.柑桔全爪螨PcSOD3的原核表達(dá)
　　以大腸桿菌BL21（DE3）作為原核表達(dá)菌株，成功實現(xiàn)了p

6、ET28α-PcSOD3重組蛋白的異源表達(dá)，利用重組蛋白所含有的His標(biāo)簽與Ni柱結(jié)合，獲得純化的重組蛋白。通過Western Blot驗證，表明所獲得的重組蛋白為PcSOD3重組蛋白，該重組蛋白酶活力為276.61U/mg，說明該重組蛋白具有抗氧化功能。酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白酶促反應(yīng)的最適溫度為35℃，最適pH為7.0。
　　4.柑桔全爪螨MnSOD和CuZnSOD抗氧化功能差異分析
　　在大腸桿菌中過量表達(dá)PcSOD

7、1、PcSOD2和PcSOD3的基礎(chǔ)上，以pET28α空載體為對照，基于濾紙片藥敏法測量三種氧化脅迫條件下的抑菌圈直徑，分析3個SOD重組蛋白的抗氧化功能差異。結(jié)果顯示，在三種氧化脅迫條件下，大腸桿菌中過量表達(dá)PcSOD3后抑菌圈的縮小程度均高于過量表達(dá)PcSOD1和PcSOD2后的抑菌圈直徑，說明柑桔全爪螨MnSOD（PcSOD3）比CuZnSOD（PcSOD1和PcSOD2）具有更強的抗氧化能力。
　　綜上所述，本學(xué)位論文為探