短桿菌膽固醇氧化酶基因的表達研究.pdf

1、膽固醇氧化酶(EC1.1.3.6COD)在食品加工、醫(yī)療檢測、生物抗蟲等方面的作用日益受到人們的重視，并且顯示出巨大的應(yīng)用潛力。本文主要研究短桿菌Brevibacteriumsp.DGCDC-82膽固醇氧化酶在大腸桿菌和在巴斯德畢赤酵母中的表達。 用PCR方法從Brevibacteriumsp.DGCDC-82染色體DNA中擴增出含信號肽序列的膽固醇氧化酶結(jié)構(gòu)基因，插入大腸桿菌表達載體pET28a(+)中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET

2、28a-COD(s+)。以pET28a-COD(s+)為底物，擴增出不含信號肽的膽固醇氧化酶結(jié)構(gòu)基因，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET28a-COD(s-)。兩種重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)均獲得活性表達，不含信號肽基因的轉(zhuǎn)化子酶活較高。在轉(zhuǎn)化子中，兩種結(jié)構(gòu)基因與pET28a(+)攜帶的His-tag融合表達，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均表達出分子量約為55kD的蛋白質(zhì)，目的蛋白大都為沒有活性的包涵體，占細胞總蛋白的50％以上。 將不含信

3、號肽的膽固醇氧化酶基因克隆至含trp/lac雙啟動子的表達載體pTrc99a中，并在大腸桿菌JM109中進行了IPTG誘導(dǎo)表達，并分別考察了誘導(dǎo)溫度、時間、IPTG濃度等因素對重組菌表達的膽固醇氧化酶的影響。在優(yōu)化條件下，該膽固醇氧化酶的酶活可以達到700U/L。酶學(xué)特性分析表明其反應(yīng)的最適pH為7.5，最適溫度為40℃。 將不含信號肽的膽固醇氧化酶結(jié)構(gòu)基因插入巴斯德畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K的EcoRI和NotI位點