家蠶第二白卵近等基因系差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、隨著家蠶基因組與功能基因研究的逐步深入，家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作為鱗翅目模式的基礎(chǔ)科學(xué)研究和蠶絲產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用需求越來(lái)越迫切，家蠶轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的研究、開(kāi)發(fā)利用已經(jīng)成為蠶業(yè)科技界關(guān)注的焦點(diǎn)，而轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體的高效檢測(cè)技術(shù)是建立家蠶高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)的核心之一。 家蠶第二白卵（w-2：10-16.1）性狀個(gè)體的卵色和眼色均呈普通遺傳，但目前人們對(duì)第二白卵性狀相關(guān)的分子機(jī)制尚缺乏了解。第二白卵對(duì)孵化、生命力、經(jīng)濟(jì)性狀等方面的影響都很小，卵及復(fù)

2、眼與正常型十分容易區(qū)分，適于作為轉(zhuǎn)基因個(gè)體篩選的標(biāo)記基因。為此，我們通過(guò)構(gòu)建家蠶第二白卵近等基因系，嘗試?yán)靡种葡麥p雜交技術(shù)（suppression subtractive hybridization，SSH）探索卵色性狀形成相關(guān)基因的線索，為進(jìn)一步闡明家蠶第二白卵性狀形成的分子機(jī)制、開(kāi)發(fā)新型轉(zhuǎn)基因標(biāo)記基因技術(shù)提供參考。 本研究取得如下主要進(jìn)展： 1. 家蠶第二白卵近等基因系構(gòu)建 以限性黑卵品種蘇卵伴為w-2基因

3、供體，與常用的正常型黑卵品種菁松A雜交，以菁松A為輪回親本進(jìn)行連續(xù)回交。累代選留經(jīng)w-2基因測(cè)交系驗(yàn)證的雄性雜合個(gè)體（＋/w-2）回交菁松A雌性個(gè)體（＋/＋）至BC6，全程實(shí)行蛾區(qū)育，BC6以后再經(jīng)2代以上同蛾區(qū)交配，獲得純合的第二白卵系統(tǒng)。由此最終建立正常型黑卵品種菁松A（以下簡(jiǎn)稱(chēng)黑卵品系）及其第二白卵近等基因系（菁松A白，以下簡(jiǎn)稱(chēng)白卵品系），其理論純合度達(dá)99％以上。 2. 家蠶第二白卵近等基因系轉(zhuǎn)色卵抑制消減雜交及文庫(kù)構(gòu)建

4、 為了獲得正常型黑卵品系相較于第二白卵品系上調(diào)表達(dá)的基因信息，選擇以正常型黑卵（菁松）為試驗(yàn)組（tester），其第二白卵近等基因系為參照組（driver）進(jìn)行抑制消減雜交，建立了消減雜交文庫(kù)。隨機(jī)選擇文庫(kù)中65個(gè)克隆進(jìn)行序列分析，共獲得65個(gè)、37種cDNA序列，長(zhǎng)度為107bp－531bp之間。對(duì)家蠶基因組和EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析表明，其中30個(gè)基因序列為家蠶基因序列，7個(gè)序列未能在家蠶基因組發(fā)現(xiàn)同源序列。 在30

5、個(gè)家蠶序列中，9個(gè)cDNA序列在2個(gè)以上克隆中出現(xiàn)，出現(xiàn)頻次占測(cè)序總克隆數(shù)的49％，推測(cè)這些序列代表了轉(zhuǎn)色卵期正常型黑卵與第二白卵之間表達(dá)量差異較大的基因。 3. H46序列cDNA3’末端快速擴(kuò)增 經(jīng)對(duì)家蠶EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析和電子雜交延伸發(fā)現(xiàn)，文庫(kù)中高頻次出現(xiàn)克隆H46序列在3’末端有2種以上拼接可能。以菁松A轉(zhuǎn)色期蠶卵的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行H46序列的3’cDNA末端擴(kuò)增，利用DNAStar軟件包中的

6、EditSeq軟件進(jìn)行拼接，確認(rèn)了菁松A轉(zhuǎn)色期蠶卵中該基因的3’末端結(jié)構(gòu)。 4.基因表達(dá)差異的半定量RT-PCR驗(yàn)證分析 選擇在文庫(kù)中2個(gè)以上克隆中出現(xiàn)的序列H46和H194作為代表，對(duì)黑卵系統(tǒng)和白卵系統(tǒng)轉(zhuǎn)色期蠶卵進(jìn)行了半定量RT-PCR驗(yàn)證分析，初步判定H46和H194序列所代表的2個(gè)基因在轉(zhuǎn)色期黑卵品系中的表達(dá)量均明顯高于白卵品系中的表達(dá)量。 5.第二白卵近等基因系間基因表達(dá)差異的定量分析 用熒光實(shí)時(shí)

7、定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了黑卵品系與白卵品系轉(zhuǎn)色期（卵齡6～36hr）蠶卵H46和H194序列所代表的基因的表達(dá)水平比較。H46在黑卵品系轉(zhuǎn)色期蠶卵中的表達(dá)量為白卵品系轉(zhuǎn)色期蠶卵的1833倍，差異非常顯著。H194在黑卵品系轉(zhuǎn)色期蠶卵中的表達(dá)量為白卵品系轉(zhuǎn)色期蠶卵的36倍，差異明顯。 本實(shí)驗(yàn)建立并利用家蠶第二白卵近等基因系實(shí)驗(yàn)為消減雜交文庫(kù)建立的材料，降低了非目標(biāo)性狀間可能存在的差異造成的假陽(yáng)性出現(xiàn)概率，在方法學(xué)上作了有益嘗試。