家蠶滯育性卵與非滯育性卵中卵殼蛋白的差異表達(dá)研究.pdf

1、卵子的形成是昆蟲繁衍和種群維持的關(guān)鍵生理過程，這一過程依次經(jīng)歷前卵黃生成期、卵黃生成期、卵殼生成期及排卵受精期幾個(gè)發(fā)育階段。在卵殼生成期，卵巢中的濾泡上皮細(xì)胞合成并分泌一些特殊的結(jié)構(gòu)蛋白，附著在卵細(xì)胞表面，形成一個(gè)復(fù)雜的胞外結(jié)構(gòu)層即卵殼。昆蟲卵殼具有保護(hù)胚胎、維持氣體交換、防止水分流失、阻止病原體進(jìn)入以及協(xié)助精子進(jìn)入卵子等重要生理作用。昆蟲卵殼干物質(zhì)的96％是蛋白質(zhì)⑴，主要包括外層卵殼層和卵黃膜層兩個(gè)結(jié)構(gòu)層。卵殼結(jié)構(gòu)及其功能是昆蟲生物學(xué)

2、研究的熱點(diǎn)之一。
　　滯育是大部分昆蟲都具有的重要生命現(xiàn)象，是昆蟲得以在自然界長期大量生存的原因之一。滯育可以發(fā)生在卵期、幼蟲期、蛹期或成蟲期。家蠶的滯育發(fā)生在囊胚期，即胚胎發(fā)育到中胚葉剛分節(jié)時(shí)細(xì)胞停止分裂，開始進(jìn)入滯育期。家蠶是典型的卵滯育型昆蟲，其滯育卵在自然條件下歷經(jīng)長達(dá)數(shù)月的冬季后，在翌年春季孵化。這段時(shí)期離不開卵殼的保護(hù)，因此卵殼在家蠶整個(gè)生活史的完成上起著尤為關(guān)鍵的作用。而家蠶的非滯育卵在自然環(huán)境中數(shù)天后會(huì)孵化，不需要

3、經(jīng)歷數(shù)月的滯育期。由于這種特殊的卵滯育性的存在，家蠶卵殼不僅存在有別于其他昆蟲的種間差異特征，還存在家蠶滯育性卵與非滯育性卵間的種內(nèi)差異。
　　本研究以鱗翅目模式昆蟲-家蠶為研究對(duì)象，先在電鏡下觀察家蠶卵殼的表面結(jié)構(gòu)，再利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)構(gòu)建其蛋白質(zhì)圖譜，通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析并鑒定滯育性卵殼和非滯育性卵殼中的蛋白質(zhì)組成及表達(dá)差異，找到與滯育相關(guān)的特征蛋白質(zhì)，以生物信息學(xué)方法分析其結(jié)構(gòu)與功能。并利用qRT-PCR方法檢測

4、相應(yīng)基因在卵巢中的表達(dá)量。得到的主要研究結(jié)果如下：
　　1.家蠶卵殼的表面結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)圖譜的構(gòu)建
　　采用二化性家蠶品種大造，蠶卵分別在高溫長光照（25℃)和低溫黑暗（15℃)條件下催青，孵化后的蠶將分別產(chǎn)滯育卵和非滯育卵，以此為實(shí)驗(yàn)材料。首先用電鏡掃描產(chǎn)下20h后卵殼的表面結(jié)構(gòu)，觀察到兩種卵殼間存在明顯的結(jié)構(gòu)差異：滯育性卵殼表面氣孔較少，這與其滯育期的代謝減弱吻合，卵紋明顯突起，推測這是滯育性卵的特殊結(jié)構(gòu)以度過滯育期。然后

5、提取卵殼的蛋白樣品，應(yīng)用2-DE獲得其雙向電泳圖譜，選取豐度較高的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)量飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析，共成功鑒定了兩種樣品的28個(gè)蛋白斑點(diǎn)，包括A類、B類、CA類、CB類和He類卵殼蛋白，建立了家蠶卵殼的蛋白質(zhì)圖譜。
　　2.差異蛋白的鑒定與功能分析
　　利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析滯育性和非滯育性卵殼的蛋白質(zhì)圖譜，得到5個(gè)有明顯差異的蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索得以鑒定，分別是

6、卵殼高半胱氨酸類蛋白（chorion class high-cysteine Hc-Aprotein12，HcAl2)、卵殼B類M2410家族蛋白（chorion class B protein M2410，B.M2410)、卵殼A類LI1家族蛋白(chorion class A protein LI1，A.L11)、卵殼B類L12家族蛋白(chorion class B protein LI2，B.L12)以及卵殼CA類ERA家族蛋白

7、（chorion class CA protein ERA.2,CA.ERA2)0其中差異最為明顯的蛋白斑點(diǎn)被鑒定為HcA12蛋白，利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)一步分析該蛋白的疏水性、二硫鍵及二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能，結(jié)果均與 He蛋白的特性相吻合。上述差異蛋白點(diǎn)的鑒定和功能分析結(jié)果為家蠶滯育的研究提供了參考依據(jù)。
　　3.差異蛋白的基因結(jié)構(gòu)分析及qRT-PCR驗(yàn)證
　　為了驗(yàn)證雙向電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以化蛹9天的滯育性和非滯育卵巢組織為材料，

8、利用qRT-PCR技術(shù)檢測其中差異蛋白相應(yīng)的基因的表達(dá)量。RT-PCR結(jié)果與雙向電泳結(jié)果一致：四種基因在滯育性卵巢中的表達(dá)量都上調(diào)，尤其是高半胱氨酸類蛋白的基因在滯育性卵巢中明顯過表達(dá)。該蛋白富含易形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，且分布在整個(gè)卵殼，與家蠶卵殼的堅(jiān)固性和難溶性有密切關(guān)系。由此推測，滯育性卵殼中部分He蛋白的過表達(dá)是為了在卵殼外層形成高度堅(jiān)韌的、能抵御不良環(huán)境的覆蓋層，從而保證胚子能夠安全地度過滯育期。其他差異蛋白與滯育的相關(guān)性還