家蠶滯育關(guān)聯(lián)miRNA及其靶基因調(diào)控關(guān)系研究.pdf

1、本文以家蠶932蠶卵為材料，采用生物信息學(xué)、PCR、qRT-PCR、DLR與ELISA等方法，通過篩查與家蠶滯育密切相關(guān)的miRNA及其靶基因，分析其在滯育卵、即時(shí)浸酸卵、赤豆色浸酸卵的表達(dá)差異及調(diào)控作用，以進(jìn)一步探索家蠶滯育發(fā)生與滯育解除的分子調(diào)控機(jī)理，取得主要結(jié)果如下：
　?。?）利用生物信息學(xué)工具RNAhybrid等對蠶卵經(jīng)浸酸后發(fā)生顯著上調(diào)或下調(diào)的miRNA各4個(gè)進(jìn)行分析，從中篩選出2個(gè)與家蠶滯育密切關(guān)聯(lián)的bmo-miR-

2、3384-3p與bmo-miR-2761-3p，并進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測，得知bmo-miR-3384-3p在候選靶基因BmNLK的3’UTR的11-64位堿基存在結(jié)合位點(diǎn)，而bmo-miR-2761-3p與BmSDH基因結(jié)合位點(diǎn)在其3’UTR的396-423位堿基。
　?。?）通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，比較候選靶基因BmNLK、BmSDH在家蠶滯育性卵、赤豆色浸酸卵中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，經(jīng)檢測分析，當(dāng)蠶卵經(jīng)鹽酸浸漬處理后，BmSDH基因和BmNLK

3、基因發(fā)生顯著上調(diào)現(xiàn)象，而在非浸酸卵中則處于低水平的表達(dá)狀態(tài)，表明兩基因在滯育性卵與浸酸卵中有明顯的差異表達(dá)。
　?。?）用qRT-PCR技術(shù)對滯育性卵與赤豆色浸酸卵在卵齡3-7d時(shí)bmo-miR-2761-3p、bmo-miR-3384-3p、BmSDH基因和BmNLK基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，結(jié)果在浸
　　酸卵中，bmo-miR-3384-3p、 bmo-miR-2761-3p的相對表達(dá)量最低時(shí)分別比浸酸前下降了76％和

4、78%，而BmNLK基因和BmSDH基因的相對表達(dá)量最高時(shí)則分別上調(diào)了217%和4287%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，bmo-miR-2761-3p與 BmSDH基因、bmo-miR-3384-3p與BmNLK基因的表達(dá)關(guān)系呈負(fù)相關(guān)性（R12=0.94，R22=0.92）。由此表明，蠶卵處在滯育狀態(tài)時(shí)，BmSDH基因、BmNLK基因低水平表達(dá)，當(dāng)蠶卵浸酸后則顯著上調(diào)。
　　（4）為驗(yàn)證bmo-miR-2761-3與BmSDH基因、bmo-miR

5、-3384-3p與BmNLK基因的靶標(biāo)關(guān)系，分別構(gòu)建了含有BmSDH3’UTR、BmNLK3’UTR的載體，并經(jīng)DLR法檢測驗(yàn)證，證實(shí)了bmo-miR-2761-3p會抑制BmSDH基因的表達(dá)；bmo-miR-3384-3p會抑制BmNLK基因的表達(dá)。
　　（5）借助ELISA方法測定了即時(shí)浸酸卵和赤豆色浸酸卵浸酸后至孵化前1d、滯育性卵于5℃冷藏0、10、20、30、40、60、80d期間的BmSDH酶和BmNLK酶的活性，結(jié)果

6、蠶卵一經(jīng)浸酸，酶活快速上調(diào)，即時(shí)浸酸卵、赤豆色浸酸卵在浸酸后經(jīng)過2d BmNLK酶的活性就到達(dá)峰值，分別為2972.24mU/g、2800.45mU/g，比對照分別提高了13.26倍和12.43倍。BmSDH酶則于浸酸后經(jīng)過3d時(shí)出現(xiàn)峰值，即時(shí)浸酸卵的為1003.36 mIU/g，赤豆色浸酸卵的為662.29 mIU/g，比對照分別提高了4.50倍和2.63倍。滯育卵在5℃冷庫中冷藏時(shí)，入庫初期酶活活性下降，當(dāng)冷藏經(jīng)過30d/20d時(shí)，