香菇（Lentinula edodes）菌絲不同發(fā)育形態(tài)差異表達基因的克隆及表達分析.pdf

1、香菇(Lentinula edodes(Berk．)Pegler)是著名的大型木腐真菌，在我國有已有800多年的栽培歷史。 香菇子實體的形成是香菇生活史中最復(fù)雜的發(fā)育過程，需要遺傳、環(huán)境、生理等因素的協(xié)同作用。在香菇子實體發(fā)育的起始階段中，菌絲首先在營養(yǎng)逆境的脅迫下進行局部地聚集而形成扭結(jié)體，隨后扭結(jié)體的密度逐漸增加而形成致密菌絲團，致密菌絲團最終發(fā)育為原基，原基本質(zhì)上是子實體的胚胎結(jié)構(gòu)。本文建立了適合香菇不同發(fā)育階段組織的RN

2、A高效提取方法，與其他常規(guī)RNA提取方法相比，該方法的獨特之處在于用有機溶劑抽提之前，加入了飽和Nacl溶液，從而促進了多糖物質(zhì)與蛋白質(zhì)的去除，并提高了RNA的產(chǎn)量，為下游的分子生物學(xué)操作打下了基礎(chǔ)。另外，本文運用mRNA差異顯示技術(shù)比較了香菇菌絲體、菌絲扭結(jié)體、致密菌絲團以及原基等四個發(fā)育階段的基因表達差異。四個發(fā)育階段的組織提取RNA后進行反轉(zhuǎn)錄，之后用隨機引物與錨定引物組合對cDNA樣品進行擴增，再用瓊脂糖凝膠電泳進行差異條帶的展

3、示。結(jié)果表明四個發(fā)育階段的基因表達差異不甚明顯，最終挑選了17個差異表達的ESTs基因片段進行克隆測序。通過與Gene Bank數(shù)據(jù)庫的比對，發(fā)現(xiàn)這些ESTs片段涉及蛋白質(zhì)的合成、細胞壁的修飾、菌絲間的相互作用、碳氮源的代謝、物質(zhì)的運輸、信號傳導(dǎo)、細胞的復(fù)蘇等過程。其中，一個差異片段被證實為內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶基因，通過Real-time PCR定量分析，發(fā)現(xiàn)該基因在疏松菌絲體、菌絲扭結(jié)體和致密菌絲團等三個階段的表達相對較低，而在原基發(fā)