斑節(jié)對蝦性腺差異表達(dá)基因的篩選、克隆及表達(dá)分析.pdf

1、斑節(jié)對蝦為重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖對蝦品種，在養(yǎng)殖條件下，其難以完成性腺發(fā)育過程并自然產(chǎn)卵，通常需用眼柄去除手術(shù)進(jìn)行人工催熟，而這種手術(shù)方法容易導(dǎo)致親蝦死亡、卵質(zhì)量下降等弊端。目前尚無其它更好的催熟技術(shù)用于啟動(dòng)斑節(jié)對蝦的性腺發(fā)育，對對蝦繁育過程中性腺發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制也不清楚，生產(chǎn)實(shí)踐和自然科學(xué)探索都迫切需要對對蝦繁殖分子調(diào)控機(jī)制有一個(gè)較深層次的了解。從分子水平認(rèn)識對蝦性腺發(fā)育的分子作用機(jī)制，探討對蝦性腺發(fā)育調(diào)控機(jī)制，發(fā)展新的催熟技術(shù)，已成為當(dāng)前研

2、究熱點(diǎn)。而目前認(rèn)識斑節(jié)對蝦性腺發(fā)育的分子機(jī)制的首要任務(wù)為篩選和鑒定與性腺發(fā)育相關(guān)的基因。 本研究利用mRNA差異顯示技術(shù)，選取池塘養(yǎng)殖250日齡的斑節(jié)對蝦為研究對象，篩選其性腺差異表達(dá)基因。首先利用3條3'端錨定引物反轉(zhuǎn)錄斑節(jié)對蝦性腺總RNA，將得到的6種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與8條隨機(jī)引物配對，進(jìn)行24組cDNA擴(kuò)增反應(yīng)，將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行6％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、硝酸銀顯色，最終獲得173條差異片段。隨機(jī)選取其中44條片段

3、回收，經(jīng)克隆測序及熒光定量PCR驗(yàn)證，最終獲得10條陽性差異表達(dá)片段，其中OA7-1、OA7-2、OG8-1、OG8-2、OC1-3、OC4-2、OC8在卵巢中表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于精巢，TG6-3、TG8在精巢中表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于卵巢，TC1為精巢特異表達(dá)片段。 利用已獲得的陽性克隆片段與本人所在實(shí)驗(yàn)室已測序完成的斑節(jié)對蝦混合組織cDNA文庫中的EST序列進(jìn)行比對分析，進(jìn)行電子克隆，并結(jié)合5'RACE技

4、術(shù)獲得斑節(jié)對蝦e1F3g(btseIF3g)、核糖體蛋白L3(btsRPL3)和L7(btsRPL7)的全長cDNA序列及一條精巢特異表達(dá)基因(btsTC1)的cDNA片段。 采用熒光定量PCR及RT-PCR方法分析了btseIF3g、btsTC1和TG6-3在250日齡的斑節(jié)對蝦各組織中的表達(dá)特性。btseIF3g在卵巢組織中的高表達(dá)現(xiàn)象暗示了其可能參與斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育；btsTC1只在精巢組織中表達(dá)，而在卵巢及雌、雄性個(gè)體的