廣州管圓線蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期差異蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文廣州管圓線蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期差異蛋白表達(dá)的研究姓名：宋增梅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：潘長(zhǎng)旺；黃慧聰20120522溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文和雄成蟲(chóng)，蟲(chóng)體用001mol／LPBS緩沖液洗滌3次后，80。C凍存。2蛋白樣品的制備：將收集的蟲(chóng)體分別使用裂解液裂解、超聲裂解、離心，獲得的上清，使用BioRadproteinassayreagent測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。分裝后80。C低溫保存。3CyDye染料標(biāo)記蛋

2、白質(zhì)：分別用Cy3或Cy5標(biāo)記樣品，Cy2標(biāo)記內(nèi)標(biāo)。4雙向熒光差異凝膠電泳(2DDIGE)41第一向等電聚焦(IEF)42膠條的平衡43第二向SDSPAGE電泳：125％的SDSPAGE凝膠5雙向熒光凝膠電泳的圖像掃描：利用U]VIaxPowerlook2110XL和TyphoonFLA9000對(duì)電泳后的膠板圖像掃描，得到不同顏色的掃描圖。6DeCyder70圖像分析7質(zhì)譜鑒定：膠內(nèi)酶解，抽提酶解肽段，ZipTip脫鹽，MALDITOF

3、MS鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果1對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)5個(gè)樣品及內(nèi)標(biāo)進(jìn)行雙向熒光差異凝膠電泳后，得到了清晰的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。用UMaxPowerlook2110XL和TyphoonFLA9000激光掃描儀于熒光模式下進(jìn)行Cy2、Cy3、Cy5激光掃描，8塊張膠共得到24張熒光掃描圖譜。2經(jīng)過(guò)DeCyder70軟件分析，校準(zhǔn)后，蛋白表達(dá)差異值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(f檢驗(yàn))，篩選出在24張圖譜中均出現(xiàn)的點(diǎn)共183個(gè)蛋白點(diǎn)。與成蟲(chóng)相比，314、537、698、925

4、和980這5個(gè)蛋白點(diǎn)在V期幼蟲(chóng)中表達(dá)上調(diào)，但沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的性別差異；與IⅡ期幼蟲(chóng)相比，點(diǎn)469、488、609、855、859、885、1253、1520和1416等89個(gè)蛋白點(diǎn)在成蟲(chóng)和V期幼蟲(chóng)中上調(diào)，相反的，點(diǎn)623、730、1053、1161和1060等13個(gè)蛋白點(diǎn)在IⅡ期幼蟲(chóng)中出現(xiàn)明顯上調(diào)；雌雄蟲(chóng)及V期幼蟲(chóng)雌雄比較中，點(diǎn)1496在雄蟲(chóng)和V期幼蟲(chóng)雄蟲(chóng)中均表達(dá)上調(diào)。3質(zhì)譜分析差異蛋白點(diǎn)，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒

5、定了其中37個(gè)蛋白質(zhì)。1081％是細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，如肌動(dòng)蛋白和副肌球蛋白；6486％功能蛋白與代謝過(guò)程、免疫反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，如熱休克蛋白和變換域相關(guān)蛋白；2432％是未知的蛋白質(zhì)。這些差異表達(dá)蛋白在細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)水解、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等許多生理和病理過(guò)程。4與V期雌蟲(chóng)相比，過(guò)氧化物氧還蛋白(1253)、吲哚胺2，3雙加氧酶(1520)和TRRAP1ikefamilymember(1521)在雌成蟲(chóng)中上調(diào)：肌鈣