PCR檢測(cè)螺類感染廣州管圓線蟲方法的研究.pdf

1、隨著人們生活水平的提高、交通日益便捷及飲食習(xí)慣的改變，使得我國近幾年來食源性疾病的病例增長迅猛，人獸共患的疾病種類也日益增多，廣州管圓線蟲病便是其中之一。自20世紀(jì)90年代以來我國先后在北京、溫州、云南和福州等地發(fā)生多起廣州管圓線蟲病小范圍的暴發(fā)流行，其中又以2006年夏秋季北京病例多達(dá)200多例為甚，引起市民的恐懼和相關(guān)方面的高度重視。 本文綜合介紹了廣州管圓線蟲病的研究現(xiàn)狀、中間宿主的種類及其診斷技術(shù)的研究現(xiàn)狀。針對(duì)目前廣州

2、管圓線蟲感染的中間宿主螺類的特點(diǎn)，本研究鑒定了來自廣州、廣西及上海等地的管圓線蟲并建立了針對(duì)廣州管圓線蟲的PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性檢測(cè)方法，其具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，并對(duì)幾種殺滅福壽螺的藥物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室初步研究。本文為貝類鮮活產(chǎn)品等體內(nèi)的廣州管圓線蟲檢測(cè)及野外帶疫普查提供了良好的診斷方法，對(duì)食品安全、預(yù)防和控制廣州管圓線蟲病暴發(fā)和流行具有重要的意義。研究結(jié)果如下： 1.蟲種鑒定：本試驗(yàn)以通用引物XZ1、N

3、C2為引物，分別對(duì)從廣西、廣州、福州及上海等地搜集的地方種管圓線蟲提取的DNA作為模板，擴(kuò)增ITS-2，通過對(duì)溫度、引物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得約250bp的片段，后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果與Genbank上廣州管圓線蟲序列相似性達(dá)99.5％，所以判斷以上幾個(gè)地方的管圓線蟲均為廣州管圓線蟲。 2.本試驗(yàn)首次建立了常規(guī)PCR方法檢測(cè)中間宿主福壽螺、非洲大蝸牛、白肉蝸牛等體內(nèi)的廣州管圓線蟲的方法。根據(jù)Genbank上廣州管圓線蟲大亞基基因序

4、列設(shè)計(jì)一對(duì)廣州管圓線蟲的特異性引物，優(yōu)化了各種PCR反應(yīng)條件，結(jié)果顯示此方法具有較高的特異性且靈敏度明顯高于組織勻漿法，達(dá)到快速、靈敏地檢測(cè)廣州管圓線蟲中間宿主的效果。 3.本研究首次成功建立了TaqMan探針檢測(cè)螺類感染廣州管圓線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)TaqMan探針及其引物，標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，對(duì)影響PCR反應(yīng)的一系列因素進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果建立的熒光PCR方法的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR檢測(cè)方法，具有時(shí)