廣州管圓線蟲(chóng)：溫州市疫源地的調(diào)查及Ⅴ期幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建.pdf

1、廣州管圓線蟲(chóng)病，亦稱嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎(eosinophilicmeningitisormeningoencephalitis，EM)，系病原體廣州管圓線蟲(chóng)(Angiostrongyluscantonensis)V期幼蟲(chóng)侵害人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)而引起。本病主要在東南亞、太平洋各島嶼及我國(guó)東南沿海流行。2003年廣州管圓線蟲(chóng)病被衛(wèi)生部列為我國(guó)新發(fā)傳染病。目前，廣州管圓線蟲(chóng)病的確診主要靠從病人腦脊液中查到蟲(chóng)體，但檢獲率很低，約為

2、10％。通常該病的診斷需依靠臨床癥狀、流行病學(xué)資料和免疫診斷。因此，建立有效的免疫診斷方法對(duì)于該病的防治有極其重要的意義。本課題旨在通過(guò)構(gòu)建廣州管圓線蟲(chóng)V期幼蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)，為獲取廣州管圓線蟲(chóng)期特異性的免疫抗原，建立敏感高效的免疫檢測(cè)手段和分子生物學(xué)技術(shù)提供材料來(lái)源。 研究目的： 本課題通過(guò)對(duì)溫州及周邊地區(qū)福壽螺采集和建立廣州管圓線蟲(chóng)病的動(dòng)物模型入手，首先對(duì)溫州及周邊地區(qū)進(jìn)行了廣州管圓線蟲(chóng)疫源地的分級(jí)，為廣州管圓線蟲(chóng)的

3、流行病學(xué)調(diào)查提供了理論依據(jù)。再者，通過(guò)感染的動(dòng)物模型獲取V期幼蟲(chóng)，構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)，為進(jìn)一步研究廣州管圓線蟲(chóng)病，尋找特異性的診斷抗原，提高廣州管圓線蟲(chóng)病的診斷技術(shù)，建立有效的免疫檢測(cè)或分子生物學(xué)檢測(cè)手段奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、廣州管圓線蟲(chóng)中間宿主(福壽螺)的采集及疫源地的分級(jí) 在溫州市及周邊地區(qū)，選擇近居民區(qū)，尤其是垃圾場(chǎng)附近的水塘、溝渠、草坡等環(huán)境，捕捉收集福壽螺。分別用不同的檢測(cè)方法檢測(cè)福壽螺體內(nèi)

4、的Ⅲ期幼蟲(chóng)，比較各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)；并用相對(duì)簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)方法對(duì)各個(gè)地區(qū)按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行疫源地的分級(jí)。 二、廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及文庫(kù)的初步鑒定 1、廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)總RNA的提?。篢RIzol法 2、廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：參照Clontech公司的SMARTcDNAlibraryconstructionkit操作 3、文庫(kù)PCR鑒定 結(jié)果： 1、從廣

5、州管圓線蟲(chóng)的中間宿主福壽螺中分離出廣州管圓線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)，其形態(tài)符合文獻(xiàn)所述： 2、成功建立了3種檢測(cè)廣州管圓線蟲(chóng)中間宿主Ⅲ期幼蟲(chóng)的方法，并對(duì)其進(jìn)行了比較和分析； 3、通過(guò)對(duì)溫州及周邊地區(qū)疫源地的調(diào)查并對(duì)各地進(jìn)行了疫源地的分級(jí)，分級(jí)顯示蒼南縣為Ⅳ級(jí)，永嘉縣為Ⅲ級(jí)，溫州市區(qū)為Ⅰ級(jí)，基本反映了當(dāng)?shù)氐囊咴吹厮健?4、成功的建立了廣州管圓線蟲(chóng)動(dòng)物感染模型，并成功獲取了廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期，與文獻(xiàn)所述的形態(tài)相符。 5、

6、廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)的總RNA的提取完整、無(wú)降解、雜質(zhì)少；0D260/OD280=1.879(OD260=0.0853，0D280=0.0454)，RNA濃度340μg/ml。 6、成功構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的廣州管圓線蟲(chóng)V期幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù)：未擴(kuò)增文庫(kù)滴度8.49×10～6fu/ml，重組效率達(dá)99.8％，擴(kuò)增文庫(kù)滴度5×109pfu/ml。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)比較了檢測(cè)廣州管圓線蟲(chóng)中間宿主的各種方法，進(jìn)行了初步的評(píng)價(jià)；對(duì)