廣州管圓線蟲幼蟲入侵小鼠血腦屏障與細(xì)胞凋亡相關(guān)性.pdf

1、目的： 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建廣州管圓線蟲幼蟲實(shí)驗(yàn)感染ICR小鼠動(dòng)物模型，采用HE染色、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)及Western-blot方法逐步檢測其腦組織細(xì)胞凋亡情況。 2.體外實(shí)驗(yàn)：經(jīng)原代分離、純化、鑒定培養(yǎng)出ICR小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞并建立血腦屏障細(xì)胞模型；廣州管圓線蟲幼蟲提取液作用血腦屏障細(xì)胞模型后觀測其功能損傷；檢測廣州管圓線蟲幼蟲提取液誘導(dǎo)血腦屏障細(xì)胞凋亡情況。探

2、討廣州管圓線蟲幼蟲入侵小鼠血腦屏障與細(xì)胞凋亡相關(guān)性。 方法： 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： (1)構(gòu)建廣州管圓線蟲幼蟲實(shí)驗(yàn)感染ICR小鼠動(dòng)物模型。 (2)取正常ICR小鼠和廣州管圓線蟲幼蟲實(shí)驗(yàn)感染ICR小鼠的腦組織，做石蠟切片行HE染色初步觀察感染鼠和實(shí)驗(yàn)鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 (3)脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察廣州管圓線蟲幼蟲實(shí)驗(yàn)感染ICR小鼠的大腦、小腦、腦干的細(xì)胞凋亡情

3、況并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。 (4)Western-blot方法檢測廣州管圓線蟲幼蟲感染第10天、13天、15天、17天的ICR小鼠腦組織內(nèi)凋亡蛋白Caspase3的變化情況。 2.體外實(shí)驗(yàn)： (1)原代培養(yǎng)方法分離、純化和鑒定ICR小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞。 (2)將培養(yǎng)好的兩種細(xì)胞在0.4μm孔徑的細(xì)胞培養(yǎng)插多孔濾膜(transwell)上下兩側(cè)進(jìn)行共培養(yǎng)，通過滲濾實(shí)驗(yàn)和通透性實(shí)驗(yàn)鑒定其符合在體狀態(tài)

4、血腦屏障特征。 (3)取廣州管圓線蟲幼蟲及其提取液作用于已構(gòu)建好的血腦屏障細(xì)胞模型，觀察對(duì)其滲濾和通透性的影響。用cck-8法檢測廣州管圓線蟲幼蟲提取液對(duì)前述原代培養(yǎng)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的生長抑制作用濃度，進(jìn)而用TUNEL和Annexin-v-FITC/PI細(xì)胞雙染方法檢測廣州管圓線蟲幼蟲提取液致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果： 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： (1)感染廣州管圓線蟲幼蟲的

5、小鼠腦組織切片經(jīng)HE染色后光鏡下進(jìn)行初步組織形態(tài)學(xué)觀察，正常對(duì)照鼠腦細(xì)胞切片細(xì)胞形態(tài)一致，細(xì)胞核完整染成均一藍(lán)色，而感染鼠腦組織切片中細(xì)胞胞體變小變圓，有核固縮、深染現(xiàn)象。 (2)TUNEL結(jié)果顯示感染廣州管圓線蟲幼蟲的ICR小鼠大腦、小腦、腦干組織均有細(xì)胞凋亡發(fā)生，細(xì)胞凋亡率分別為20％、50％和70％。 (3)Western-blot結(jié)果顯示隨著廣州管圓線蟲幼蟲感染ICR小鼠的感染時(shí)間的延長，感染鼠腦組織的活性Cas

6、pase3量遞增，全長Caspase3量遞減，表明組織細(xì)胞凋亡的程度逐步增加。 2.體外實(shí)驗(yàn)： (1)經(jīng)原代分離、純化、鑒定出ICR小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞并成功構(gòu)建血腦屏障細(xì)胞模型。 (2)將廣州管圓線蟲幼蟲及其提取液作用于血腦屏障細(xì)胞模型后可引起其滲濾和通透性增加，導(dǎo)致其屏障功能損傷。 (3)TUNEL和Annexin-v-FITC/PI細(xì)胞雙染結(jié)果證實(shí)廣州管圓線蟲幼蟲提取液可致原代培養(yǎng)的I