胎兒生長受限與胎盤細(xì)胞凋亡相關(guān)性研究.pdf

1、目的：細(xì)胞凋亡亦稱程序性細(xì)胞死亡，是多細(xì)胞生物體正常的生理死亡過程，用以清除不需要的或?qū)ψ陨碛泻Φ募?xì)胞，但若凋亡過度或不足，均可導(dǎo)致疾病。近年來，對細(xì)胞凋亡的研究多集中于腫瘤方面，而對胎盤細(xì)胞的研究較少。胎盤是母兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要器官，它具有幾乎所有人體器官功能的作用，包括氣體交換、營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)、排除胎兒代謝產(chǎn)物、合成防御等功能，使胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育處最佳環(huán)境。因此，凡影響胎盤發(fā)育的因素，均可影響胎兒發(fā)育。通過電鏡觀察，胎兒生長受限、

2、早產(chǎn)、妊高征等，其病理生理變化均為螺旋小動脈末端在進(jìn)入絨毛間隙前，有血管硬化和纖維沉著及血栓形成，造成血管部分或完全堵塞，致使子宮-胎盤間血循環(huán)不足。Allaire等通過對31例先兆子癇(重度妊高征)病例和31例正常妊娠病例比照分析得出結(jié)論：先兆子癇組比對照組胎盤細(xì)胞凋亡顯著增多。因此推論，胎兒生長受限組胎盤細(xì)胞凋亡亦較對照組多。我們隨機(jī)選擇唐山地區(qū)23例胎兒生長受限病例與對照組進(jìn)行比照分析，旨在探討胎兒生長受限與胎盤細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。

3、 方法：1標(biāo)本的提?。哼x擇符合條件的胎兒生長受限病例的胎盤及正常妊娠婦女的胎盤，待其自然娩出后，用生理鹽水洗凈血液-固定-取石蠟包埋備用。 2TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡：TUNEL法即脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法，實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)細(xì)胞和從組織中

4、分離的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛應(yīng)用。 2.1取石蠟包埋組織，切取5微毫米切片，貼附于硅化玻片60℃烤干備用。 2.2主要試劑：原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒[Kit，AP]系德國BOEHRINGERMANNHEIM公司產(chǎn)品，參照試劑盒設(shè)立對照組。蛋白酶K系Sigma公司產(chǎn)品。BCIP/NBT底物液系DAKO公司產(chǎn)品。 2.3TUN

5、EL法標(biāo)記凋亡細(xì)胞：石蠟包埋組織切片常規(guī)脫蠟至水，20mg/L蛋白酶K于37度消化20min，PBS洗滌3次，參照試劑盒加50uLTUNEL反應(yīng)液，于37度孵育60minPBS洗滌3次，加50uL轉(zhuǎn)換-AP液，于37度孵育30min，PBS洗滌3次，加50uLNBT/BCIP底物液，于室溫下顯色8min，PBS洗去底物液，常規(guī)封片，備鏡檢。 2.4鏡檢：高倍鏡下于標(biāo)本，觀察3-10個(gè)不同視野，共觀察200-600個(gè)細(xì)胞核，計(jì)數(shù)T

6、UNEL染色陽性，即細(xì)胞核染成深蘭色或紫黑色的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算其平均細(xì)胞調(diào)亡率。在HE切片上，凋亡一般累及單個(gè)或小堆細(xì)胞。單個(gè)凋亡的細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，細(xì)胞皺縮呈圓形或卵圓形。核染色質(zhì)濃集成深蘭色或紫黑色致密的球狀，或染色質(zhì)重新分布于核膜下呈圓形或呈新月形。 3.用電鏡進(jìn)一步檢測細(xì)胞凋亡：凋亡細(xì)胞染色質(zhì)固縮，常聚集于核膜呈境界分明塊狀或新月型小體，細(xì)胞漿濃縮或裂解成質(zhì)膜包繞的碎片。單純或繼發(fā)性壞死細(xì)胞也可出現(xiàn)核固縮，但染色

7、質(zhì)分布無規(guī)律，邊界不清。 4.數(shù)據(jù)處理：采用SPSS8.0ForWindows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)比較FGR組與對照組的胎盤細(xì)胞平均凋亡率間有無差異，而兩組間孕產(chǎn)婦年齡、孕齡、體重等有無差異采用方差分析進(jìn)行檢測。 結(jié)果：光鏡下凋亡細(xì)胞核被染成深蘭色或紫黑色，進(jìn)一步電鏡觀察，可見凋亡的典型表現(xiàn)，染色質(zhì)固縮，聚集于核膜下，胞質(zhì)空泡化。經(jīng)方差分析顯示FGR組與正常對照組孕婦孕周、年齡、體重等比較，差異無顯著性(P＞0