SIV入侵血腦屏障的分子機(jī)制探討.pdf

1、獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)簡(jiǎn)稱艾滋病，是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染機(jī)體后，引起的一種以細(xì)胞免疫功能缺陷、反復(fù)機(jī)會(huì)性感染、惡性腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?yōu)樘攸c(diǎn)的綜合癥。HIV進(jìn)入人體后，不僅攻擊免疫系統(tǒng)，還常常伴隨有嚴(yán)重的神經(jīng)侵襲性，通常的病理變化為星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生為主的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、血管周圍

2、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞侵潤。臨床上表現(xiàn)為從急性腦炎到HIV癡呆合并癥等一系列不同的變化。在動(dòng)物模型中，CNS疾病通常與腦實(shí)質(zhì)特別是HIV對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的直接感染相關(guān)。
　　那么，HIV是怎樣進(jìn)入CNS的呢？目前研究表明，HIV/SIV在感染早期即可穿透血腦屏障(BBB)，侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。關(guān)于其感染機(jī)制，存在幾種不同的假說，其中比較公認(rèn)的是:(1)病毒直接侵入假說;(2)單核-巨噬細(xì)胞侵入假說;(3

3、)T細(xì)胞誘導(dǎo)假說;(4)液相入胞假說等。簡(jiǎn)單來說，即病毒以游離病毒的形式或以感染病毒的細(xì)胞為載體，藉由上皮細(xì)胞或細(xì)胞間緊密連接處進(jìn)入并感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)。那么究竟游離病毒直接感染內(nèi)皮細(xì)胞的感染方式，還是感染的T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的感染方式是SIV入侵血腦屏障的主要途徑呢？如果細(xì)胞介導(dǎo)的感染方式是主要途徑，那在，感染的淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞作用時(shí)，又是什么分子發(fā)揮了促進(jìn)SIV感染內(nèi)皮細(xì)胞的作用呢？
　　第一部分 游離SIVmac239病毒與T細(xì)

4、胞介導(dǎo)兩種方式感染內(nèi)皮細(xì)胞的效果比較。游離病毒直接感染與細(xì)胞介導(dǎo)兩種感染方式，無疑是HIV/SIV感染細(xì)胞的兩種方式。有研究表明，在HIV感染CD4+T細(xì)胞時(shí)，感染的T細(xì)胞與未感染的T細(xì)胞間的接觸，會(huì)形成一種特殊的結(jié)構(gòu)-病毒學(xué)突觸。這種結(jié)構(gòu)會(huì)促進(jìn)HIV病毒從感染細(xì)胞到未感染細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)移。這種細(xì)胞介導(dǎo)的感染方式是游離病毒直接感染方式效率的100倍之多。那么在SIV感染內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，感染的T細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，會(huì)不會(huì)也由于細(xì)胞間的接觸，促

5、進(jìn)SIV對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的感染呢？
　　為此，我們采用游離SIV病毒直接感染內(nèi)皮細(xì)胞和SIV感染的CEMx174細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的兩種方式，通過巢式PCR、間接免疫熒光法、Western blotting以及ELISA檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的感染程度。我們發(fā)現(xiàn)，兩種感染方式都能在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到前病毒DNA。但感染細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)前病毒DNA含量、SIV P27蛋白表達(dá)量和細(xì)胞培養(yǎng)上清中P27含量遠(yuǎn)高于游離病毒直接感染的方式

6、。所以我們得出結(jié)論:細(xì)胞介導(dǎo)的感染方式相較于游離病毒直接感染方式對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的感染能力更強(qiáng)，可能是SIV病毒入侵血腦屏障的主要途徑。
　　第二部分 CD44分子與透明質(zhì)酸分子的相互作用對(duì)SIV感染內(nèi)皮細(xì)胞的影響。淋巴細(xì)胞表面的CD44分子與內(nèi)皮細(xì)胞表面的透明質(zhì)酸分子參與了淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，有證據(jù)顯示在體外淋巴細(xì)胞表面的CD44分子能通過透明質(zhì)酸依賴的途徑結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞上。既然T細(xì)胞表面的CD44分子與內(nèi)皮細(xì)胞表面的HA分

7、子能相互作用促進(jìn)淋巴細(xì)胞的歸巢，那么這種相互作用又能否促進(jìn)SIV對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的感染呢？為此，我們采用IFA、Western blotting、 FCM等方法，通過熒光共定位證明了T淋巴細(xì)胞表面的CD44分子確實(shí)可以和內(nèi)皮細(xì)胞表面的透明質(zhì)酸分子相結(jié)合，促使淋巴細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用。通過添加外源性的透明質(zhì)酸分子與淋巴細(xì)胞表面的CD44分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，以及利用透明質(zhì)酸酶減少透明質(zhì)在內(nèi)皮細(xì)胞表面的分布有效地降低了SIV通過T細(xì)胞介導(dǎo)的途徑對(duì)內(nèi)

8、皮細(xì)胞的感染。同理，利用抗體封閉T淋巴細(xì)胞CD44分子與透明質(zhì)酸分子的結(jié)合位點(diǎn)，降低CD44-HA的結(jié)合，同樣降低了SIV對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的感染。
　　第三部分 大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的永生化。由于在研究SIV入侵血腦屏障時(shí)，缺乏工具細(xì)胞-恒河猴腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致我們?cè)谘芯縎IV入侵血腦屏障時(shí)，使用與腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞均為CD4-的猴視網(wǎng)膜脈絡(luò)叢內(nèi)皮細(xì)胞（RF/6A）。本實(shí)驗(yàn)選用全骨貼壁法分離大鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞，14d即可在顯微鏡下觀察

9、到梭形透亮狀態(tài)良好的貼壁細(xì)胞，經(jīng)流式鑒定P3代CD90+細(xì)胞占總體細(xì)胞的95.6％。通過重組腺病毒介導(dǎo)的方法使hTERT基因在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的異位穩(wěn)定表達(dá)，誘導(dǎo)端粒酶性，維持細(xì)胞染色體核型的穩(wěn)定，目的是使大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的壽命明顯延長成為具有分化潛能且無限增殖潛能的理想細(xì)胞材料。為恒河猴MSC細(xì)胞永生化的研究起到了鋪墊作用。而恒河猴MSC細(xì)胞永生化無疑為分化出腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞提供了良好的基礎(chǔ)。
　　總的來說，我們研究發(fā)