血腦屏障緊密連接在人腦膠質(zhì)瘤中的變化及其分子機制.pdf

1、研究背景:
　　 血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu),它對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有極其重要的意義。BBB的存在,使中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部內(nèi)環(huán)境成為區(qū)別于人體其他內(nèi)環(huán)境的相對獨立整體,從而保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常進行各項生理活動。目前認為,血腦屏障是由無窗孔的毛細血管內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接(tight junction,TJ)、星形膠質(zhì)細胞足突、細胞基膜和周細胞共同組成的一個細胞復

2、合體。在這個細胞復合體中主要的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎是毛細血管內(nèi)皮細胞及其緊密相連,緊密連接結(jié)構(gòu)相當穩(wěn)定,主要起屏障和粘連作用,它與腦毛細血管內(nèi)皮細胞組成血腦間物質(zhì)交換的第一道屏障。在人體組織分布上,緊密連接各分子元件的表達有明顯的組織特異性。這些表達不同的分子元件在人體內(nèi)可以組裝形成具有不同通透性功能的組織屏障進而適應不同組織器官的功能需要。在血腦屏障中,目前發(fā)現(xiàn)構(gòu)成緊密連接的主要分子元件有:①跨膜蛋白claudin-5,claudin-1,o

3、ccludin,JAM；②胞漿附屬蛋白ZO-1,ZO-2,ZO-3,7H6與cingulin。而血腦屏障胞旁緊密連接通道功能(paracellular-tight junction channels,PTJC)、柵欄功能(fence function)等也被相繼的發(fā)現(xiàn)。血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能的完整性對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關重要,同時,緊密連接結(jié)構(gòu)與功能的變化也是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理生理變化的核心過程。隨著神經(jīng)腫瘤學的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn),

4、膠質(zhì)瘤細胞可以在其發(fā)生、發(fā)展過程中對血腦屏障產(chǎn)生多種作用進而導致多種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及并發(fā)癥的產(chǎn)生。膠質(zhì)瘤細胞浸潤、生長所導致的血腦屏障緊密連接的“破壞”是膠質(zhì)瘤性腦水腫和癲癇等多種臨床表現(xiàn)及并發(fā)癥發(fā)生的主要因為之一。
　　 腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率最高的原發(fā)性腦腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤的40％左右。目前,即使采用手術、放療、化療等綜合治療,腦膠質(zhì)瘤患者的平均五年生存率常不到30％。盡管近十年來,人們在腦膠質(zhì)瘤的基礎與臨床研究方面都取得了很大

5、的進步,但腦膠質(zhì)瘤仍是致殘率、致死率最高的惡性腫瘤之一。其中,作為膠質(zhì)瘤最常見類型之一的膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma,GBM),其平均生存時間更在過去的三十年間無明顯改善。但是,膠質(zhì)瘤細胞如何引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理生理變化?其分子機制如何?這是當前膠質(zhì)瘤研究中的一個薄弱環(huán)節(jié)。除此之外,研究者們還發(fā)現(xiàn),位于膠質(zhì)瘤瘤周和瘤體內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接可以演變成一種特殊的“血瘤屏障”(blood-tumor barrier

6、,BTB)。這一“屏障”的存在也是目前嚴重制約腦膠質(zhì)痛臨床療效的重要因為之一。長期以來,有關血腦屏障緊密連接在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具體結(jié)構(gòu)和功能變化及其機制一直不是十分清楚。
　　 對于血腦屏障緊密連接在腦膠質(zhì)瘤中的形態(tài)學改變,許多文獻敘述卻不盡相同。而在膠質(zhì)瘤對血腦屏障緊密連接的影響方面,不同的學者也取得了“開放”與“完整”的不同研究結(jié)果。為了研究膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障的形態(tài)學改變,本研究通過分析21例人腦膠質(zhì)瘤標本來探索膠質(zhì)

7、瘤細胞對血腦屏障的超微結(jié)構(gòu)的影響；同時,隨著現(xiàn)代分子生物學與實驗技術的進步,如何從分子水平上闡明膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障緊密連接的作用及其分子機制與病理生理意義已成為神經(jīng)腫瘤學研究的當務之急。研究表明,在構(gòu)成緊密連接的多種分子元件中,Claudins目前被認為是形成緊密連接超微結(jié)構(gòu)、決定緊密連接屏障特性和離子通透特性的主要元件。Claudins是緊密連接復合體的主要跨膜蛋白,而Claudin-5是腦微血管內(nèi)皮細胞間緊密連接中的主要黏附分子。

8、目前研究表明,在構(gòu)成緊密連接的多種分子元件中,Claudin-5是構(gòu)成內(nèi)皮細胞緊密連接的骨架蛋白,它參與維持緊密連接特有的柵欄功能和屏障功能,被認為是形成緊密連接超微結(jié)構(gòu)、決定緊密連接屏障特性和離子通透性的主要元件,是緊密連接形成的必要條件。在很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,表達下降的Claudin-5已經(jīng)被證明與血管通透性增加有著密切的關系。在小腦成血管母細胞瘤中,腦微血管內(nèi)皮細胞Claudin-5表達的下降是其形成瘤囊的重要因為之一。為了研究腦

9、膠質(zhì)瘤血腦屏障緊密連接主要分子元件的表達變化,從分子水平上闡明膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障緊密連接的影響及其可能的分子機制與病理生理意義,本研究利用免疫熒光雙標及RT-PCR技術,探索了膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障緊密連接分子元件Claudin-5的影響及其可能的分子機制。
　　 目的:
　　 1.研究腦膠質(zhì)瘤血腦屏障內(nèi)皮細胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)的變化,為腦膠質(zhì)瘤中血腦屏障的形態(tài)學改變提供理論基礎。
　　 2.闡明血腦屏障內(nèi)皮細胞

10、間緊密連接結(jié)構(gòu)的變化在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的病理生理意義。
　　 3.研究腦膠質(zhì)瘤血腦屏障緊密連接主要分子元件的表達變化,從分子水平上探索膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障內(nèi)皮細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的變化及其可能的分子機制。
　　 方法:
　　 1.統(tǒng)計21例腦膠質(zhì)瘤病例的一般情況,收集上述病例手術后切除的腦膠質(zhì)瘤組織標本,并收集6例癲癇顳葉切除的顳極遠隔部位標本作為正常腦組織對照組；把27例標本分為三組:正常腦組織組、低級別膠

11、質(zhì)瘤組與高級別膠質(zhì)瘤組。
　　 2.采用透射電鏡觀察腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織血腦屏障內(nèi)皮細胞間緊密連接的超微結(jié)構(gòu)特征；
　　 3.運用免疫熒光雙標染色觀察腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織血腦屏障內(nèi)皮細胞間緊密連接蛋白Claudin-5的表達；
　　 4.采用半定量RT-PCR的方法探索膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白分子元件Claudin-5表達的影響。
　　 5.統(tǒng)計學分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件

12、包分析。數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,不同級別膠質(zhì)瘤及正常組Claudin-5 mRNA條帶OD比值比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用Bonferroni法,以P≤0.05為差異有顯著性意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.在透射電鏡下,正常腦組織微血管相鄰內(nèi)皮細胞間可見連續(xù)條帶狀的緊密連接,細胞間未見裂隙；在低級別膠質(zhì)瘤中,多數(shù)微血管內(nèi)皮細胞間可見連續(xù)的緊密連接,未見明顯窗口形成；在高級別膠質(zhì)瘤中,微血管內(nèi)皮細胞間緊密連接

13、破壞嚴重,內(nèi)皮細胞間可見明顯裂隙,在局部還可見殘存的緊密連接,部分內(nèi)皮細胞間連接為縫隙連接,內(nèi)皮細胞上偶見窗口形成,胞漿中吞飲小泡明顯增多,尤以多形性膠質(zhì)母細胞瘤為著,內(nèi)皮基膜局部有蟲蝕狀空洞形成。
　　 2.免疫熒光雙標染色觀察在正常腦組織中,微血管內(nèi)皮細胞上可見大量Claudin-5表達；在低級別膠質(zhì)瘤中,微血管內(nèi)皮細胞上Claudin-5的表達略降低；在高級別膠質(zhì)瘤中,微血管內(nèi)皮細胞上無明顯Claudin-5的表達。

14、>　　 3.PCR結(jié)果顯示,正常腦組織、低級別膠質(zhì)瘤、高級別膠質(zhì)瘤Claudin-5 mRNA表達的相對強度分別為:0.633±0.068、0.519±0.172、0.227±0.148；經(jīng)比較,高級別膠質(zhì)瘤Claudin-5 mRNA與正常腦組織、低級別膠質(zhì)瘤差別有統(tǒng)計學意義(F=17.283,P=0.000),但正常腦組織與低級別膠質(zhì)瘤Claudin-5 mRNA的表達水平差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論:<

15、br>　　 1.膠質(zhì)瘤細胞在其發(fā)生、發(fā)展過程中通過與血腦屏障內(nèi)皮細胞的相互作用破壞血腦屏障內(nèi)皮細胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)。
　　 2.在不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中,血腦屏障緊密連接受破壞的程度不同,腦膠質(zhì)瘤的級別越高,血腦屏障緊密連接完整性受破壞的程度越大。
　　 3.在不同級別腦膠質(zhì)瘤中,膠質(zhì)瘤細胞能通過多種途徑降低血腦屏障內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白Claudin-5的表達。膠質(zhì)瘤級別越高血腦屏障內(nèi)皮細胞間緊密連接蛋白Claudi