蟲草素改善腦外傷大鼠模型中血腦屏障損害的機制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)，是指一類由各種外傷導致腦組織嚴重損害的疾病，具有高發(fā)生率、高致殘率等特點，它的致死率、致殘率居創(chuàng)傷的首位[1]。僅在美國，每年大約有170萬例新病例報告，導致約5％的人死亡，超過40％的人長期殘疾，和有25％的成年人受到影響，無法在TBI后1年返回正常工作[2-4]。而在發(fā)展中國家，隨著社會經(jīng)濟水平不斷提高，交通工具的普及、建筑的大力發(fā)展、

2、高刺激運動的引入等等，使TBI的發(fā)病率呈持續(xù)升高的趨勢。在TBI后可以出現(xiàn)相關的臨床癥狀，造成廣泛的心理和身體的障礙，包括運動障礙、癲癇、人格改變、記憶障礙、感覺障礙等。所以，TBI是一個影響公眾的主要的健康問題。然而，目前仍沒有經(jīng)過FDA批準的腦外傷的治療，對它的研究迫在眉睫。
　　血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)完整性的破壞參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括缺血、多發(fā)性硬化和神經(jīng)退行性疾病比如AD、帕金

3、森病等[5-8]。通過影像學研究發(fā)現(xiàn)人的血腦屏障完整性在TBI后被破壞[9]。Alluri等研究也發(fā)現(xiàn)腦外傷可引起B(yǎng)BB的完整性的損失，它可以不再是血管內(nèi)皮和大腦之間完美的保護屏障，它的功能障礙導致液體、蛋白質和免疫細胞的滲出，從而形成血管源性腦水腫，繼發(fā)一系列的神經(jīng)損傷，甚至留下嚴重的神經(jīng)功能障礙[10]。因此改善血腦屏障的破壞對于改善TBI的結局至關重要。
　　生理狀態(tài)下BBB對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。在血腦屏

4、障的完整結構中，腦微血管內(nèi)皮細胞由Occludin、Claudins和JAMS(junctionAdhesion molecules)三種跨膜蛋白連接形成，其與緊密連接蛋白中閉鎖小帶蛋白-1(Zonulaoccludens-1，ZO-1)直接或間接結合，連接到細胞骨架蛋白，穩(wěn)定整體的連接結構。而liu等研究發(fā)現(xiàn)ZO-1和occludin對血腦屏障很關鍵[11]。有研究發(fā)現(xiàn)在一個大鼠的寒冷損傷模型中，皮層產(chǎn)生純血管源性水腫，在caveol

5、in-1的表達增加的同時，發(fā)現(xiàn)了occludin和claudin-5表達的減少[12]。
　　此外，BBB的完整性，也為某些生理條件的影響，包括炎癥和氧化應激。局部炎癥反應可導致血腦屏障破壞。在這一過程中，促炎性細胞因子，包括IL-1、iNOS、MPO和MMP-9，均可由腦損傷引起，同時抗炎癥相關因子arginase-1和IL-10因為保護作用被激活。研究還發(fā)現(xiàn)中風后過量的活性氧(Reactive oxygenspecies，RO

6、S)導致血腦屏障完整性的破壞，而NOXs是ROS的主要來源。[13-20]
　　綜上所述，腦外傷后導致血腦屏障的破壞，而維系血腦屏障的緊密連接蛋白異常及炎癥和氧化應激均會導致血腦屏障通透性增加，從而出現(xiàn)血管源性水腫、顱內(nèi)壓增高，出現(xiàn)相應的臨床癥狀，而治療上目前無FDA批準的腦外傷的治療，既往研究發(fā)現(xiàn)格列本脲、柴胡皂甙、丁酸鈉等藥物對創(chuàng)傷性腦損傷后的血腦屏障的破壞有保護作用，且Yang等對既往中草藥治療TBI的文獻進行meta分析，

7、結果顯示中藥對TBI治療有益，且有明顯的統(tǒng)計學意義，但有局限性，表明更精心設計和報告的動物研究是必要的[21-24]。
　　蟲草素(cordycepin)又稱蟲草菌素，具有抗炎、清除體內(nèi)自由基抗氧化、抗腫瘤、抗白血病、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等作用[25]，Tuli等研究發(fā)現(xiàn)蟲草素能明顯減弱促炎癥因子的水平，包括NO、PGE2、TNF-α和IL-1，同時增加抗炎因子的表達，如IL-10[26]。此外，蟲草素可減少與年齡相關的

8、氧化應激，改善大鼠抗氧化能力[27]。蟲草素通過抗氧化性能和抑制凋亡細胞死亡來發(fā)揮對海馬細胞的神經(jīng)保護作用[28]。因此，有必要探討蟲草素是否對腦外傷后血腦屏障受損有保護作用。
　　本實驗通過使用TBI大鼠作為體外模型，運用多種技術，包括神經(jīng)缺損嚴重程度的評價、伊萬思藍評估、實時熒光定量PCR、Western blotting和ELISA等，來探討蟲草素是否通過抑制炎癥、抗氧化應激和緊密連接蛋白的減少來改善腦外傷后的血腦屏障破壞，

9、并為臨床上找到一種治療TBI的新辦法。
　　方法:
　　1.使用SD大鼠隨機分組并通過經(jīng)典的控制皮層沖擊傷裝置制作TBI大鼠模型。
　　2.損傷嚴重程度的評價。根據(jù)1996年chen[29]等進行神經(jīng)損傷嚴重程度評分，采用10分量表，0分代表正常，10分代表最嚴重的神經(jīng)功能缺損。
　　3.腦含水量的測定:按照Hatashita等應用干濕重法測定傷后24小時腦組織含水量。
　　4.伊文思藍的評價:通過術后伊萬

10、思藍滲漏評價BBB的通透性。
　　5.實時熒光定量PCR:損傷24小時后，組織勻漿后應用RNA裂解緩沖液，根據(jù)試劑盒指示分別提取RNA、合成cDNA和其后的qPCR來測定ZO-1、occludin、IL-1β、iNOS、MMP-9、arginase-1、NOX-1、NOX-2、NOX-4、GADPH作為內(nèi)參對照。
　　6.Western blotting:如上所述，收集24小時后損傷組織，應用Westernblotting來

11、觀察組成血腦屏障的ZO-1和Occludin的表達情況。
　　7.ELISA:參照western blotting方法提取損傷24小時后總蛋白，根據(jù)試劑盒的指示來檢測IL-10。最后結果是以pg/mg來顯示.
　　8.評估MPO和NOX的活性:應用MPO測試盒（比色法）和光澤精增強化學發(fā)光法來評估MPO和NOX的活性。
　　9.統(tǒng)計:統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism軟件統(tǒng)計分析(GraphPad軟件、

12、美國)，用單因素方差分析和Tukey的事后檢驗法。P值小于0.05被視為統(tǒng)計學意義。每項實驗至少重復三遍。
　　結果:
　　1.蟲草素治療能改善TBI誘導的損傷，但呈劑量依賴
　　假手術組大鼠接受相同的手術，但均沒有影響皮質。TBI大鼠分別用生理鹽水（對照組）或蟲草素(1、5、10和20mg/kg)。不同實驗組動物的腦卒中嚴重程度以神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴重程度評分、腦含水量為特征。我們的研究結果表明，比假手術組，TBI大鼠有較

13、高的神經(jīng)功能缺損程度評分和更多的腦水含量。此外，給予蟲草素干預治療后，比對照組表現(xiàn)出較低的神經(jīng)功能缺損程度評分和較少的腦水含量，表明蟲草素可以治療腦外傷引起的損傷。此外，蟲草素的治療作用具有劑量依賴性，在我們的實驗中，20mg/kg的蟲草素改善TBI的效果最好。
　　2.蟲草素治療可保護TBI后的BBB的完整性。
　　伊萬思藍可以評定BBB的完整性，因為伊萬思藍滲漏與BBB完整性的損失呈正相關。我們的研究發(fā)現(xiàn)對照組血腦屏障完

14、整性受損，而20mg/kg蟲草素治療組可部分挽救TBI誘導的BBB完整性的損失。伊萬思藍的含量分析進一步證實，蟲草素可治療TBI誘導的血腦屏障完整性受損。此外，假手術組大鼠，作為陰性對照組，在受損的對側，伊萬思藍含量和蟲草素處理組沒有差異。
　　3.蟲草素能減輕TBI誘導的同側皮層緊密連接蛋白的損失。
　　假手術組和TBI組相比較，假手術組大鼠的ZO-1和occludin轉錄水平較低。此外，在假手術組大鼠和假手術組+蟲草素組

15、之間及TBI+對照組和TBI+蟲草素組之間ZO-1和occludin的mRNA水平各自相似。其后通過免疫印跡法檢測兩者的蛋白表達水平，結果顯示與mRNA結果一致，TBI大鼠組(TBI+對照組和TBI+蟲草素組)ZO-1和occludin蛋白水平較低。然而，對ZO-1和occludin蛋白條帶強度的統(tǒng)計分析證實TBI+蟲草素組顯著高于TBI+對照組，表明蟲草素能減輕TBI誘導緊密連接蛋白的損失，但不影響基因?？傊?，蟲草素可能在轉錄后水平發(fā)

16、揮神經(jīng)保護作用。
　　4.蟲草素能抑制腦損傷同側大腦的局部炎癥。
　　我們分析了促炎因子和抗炎因子的水平，包括IL-1β、iNOS、MMP-9、MPO和arginase-1、IL-10，正如預期的那樣，局部炎癥在TBI后同側大腦引起，但被蟲草素抑制。同時，TBI誘導的腦損害刺激抗炎癥因子產(chǎn)生，而蟲草素可以進一步加強這種作用。
　　5.蟲草素能抑制NADPH oxidase(NOX)在TBI后同側大腦的表達和活性。

17、>　　我們的研究結果證實，腦損傷大鼠組NOX活性比對照組高，而蟲草素治療TBI大鼠組比TBI對照組大鼠NOX活性低。NOX-1、NOX-2和NOX-4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在NOXs的三種類型[31]。我們進一步研究三種NOXs的mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)在TBI誘導的大鼠中只有NOX-1，它卻在TBI大鼠中蟲草素治療后被抑制。但NOX-2和NOX-4不受TBI誘導的損傷影響，也不被蟲草素治療影響。
　　結論:
　　1.蟲草素對腦

18、外傷引起的腦損傷有保護作用，且呈劑量依賴性。
　　2.蟲草素可以改善腦外傷引起的血腦屏障的破壞。
　　3.蟲草素對血腦屏障的保護可能是通過恢復緊密連接蛋白ZO-1和occludin的轉錄后表達水平、抑制局部炎癥反應和降低NOX-1的活性來實現(xiàn)。
　　意義:
　　1.我們對蟲草素改善創(chuàng)傷性腦損傷后血腦屏障完整性損害的機制進行了探討，首次提出蟲草素對腦外傷后血腦屏障的保護作用，發(fā)現(xiàn)蟲草素可以通過減少血腦屏障相關的緊密