艾塞那肽與胰島β細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究.pdf

1、2型糖尿病是因胰島素分泌不足或其作用缺陷所致的以血糖升高為主要特征的一種常見(jiàn)的代謝性疾病。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人口平均壽命的延長(zhǎng)，糖尿病的發(fā)病率持續(xù)提高并有發(fā)病年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響全球人類(lèi)的健康。近年來(lái)，我國(guó)糖尿病的患病人數(shù)增長(zhǎng)速度令人震驚。目前的內(nèi)分泌治療主要包括飲食控制、藥物干預(yù)、合理運(yùn)動(dòng)，但口服降糖藥物難以維持穩(wěn)定的血糖，注射胰島素的依從性差，使得絕大多數(shù)糖尿病患者的血糖控制并不理想，最終難以避免發(fā)生各種糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，比如

2、失明、腎功能衰竭、腦卒中、糖尿病足等。糖尿病的病因復(fù)雜，機(jī)制不明，近期內(nèi)科治療難有突破性的進(jìn)展。
　　近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)顯示，手術(shù)治療糖尿病確有療效，不僅能從根本上控制血糖，還能阻止糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，被認(rèn)為是一種新的安全、有效的治療方法，給糖尿病患者帶來(lái)了希望。在2011年，國(guó)際糖尿病聯(lián)盟正式推薦外科手術(shù)為肥胖合并2型糖尿病的治療方法。雖然手術(shù)治療糖尿病療效確切，但其治療機(jī)制尚在不斷研究中。目前的研究結(jié)果中，胰高血糖素樣

3、肽-1被認(rèn)為是糖尿病患者在術(shù)后參與調(diào)節(jié)胰島素控制血糖的主要胃腸道激素之一。在糖尿病患者中，胰高血糖素樣肽-1存在表達(dá)下調(diào);而在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)流術(shù)后的糖尿病患者中，胰高血糖素樣肽-1較對(duì)照組有明顯的表達(dá)上調(diào)，提示胰高血糖素樣肽-1可能是糖尿病患者在術(shù)后血糖得以控制的重要因素。
　　胰高血糖素樣肽-1由遠(yuǎn)端小腸的L細(xì)胞分泌，在體內(nèi)可被廣泛存在的二肽基肽酶-4快速滅活。而胰高血糖素樣肽-1的類(lèi)似物艾塞那肽，不僅模擬了胰高血糖素樣肽-1的功能，還

4、不會(huì)被二肽基肽酶-4滅活，是近年來(lái)用于臨床的新型短效降糖藥，具有有效控制血糖、保護(hù)β細(xì)胞、減輕體重、保護(hù)心血管、改善非酒精性脂肪肝病等療效。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究胰高血糖素樣肽-1類(lèi)似物艾塞那肽(Exendin-4)抑制RIN-m5f胰島素瘤細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，探討胃腸轉(zhuǎn)流手術(shù)治療2型糖尿病的可能機(jī)制，為手術(shù)治療糖尿病提供更多的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定刺激大鼠胰島素瘤RIN-m5

5、f細(xì)胞的高糖濃度和刺激時(shí)間
　　將RIN-m5細(xì)胞分為A、B、C三組，然后接種于96孔板，每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。
　　A組使用含糖濃度為11.1mmol/L的完全培養(yǎng)基，B組交替使用含糖濃度為22.2mmol/L和11.1mmol/L的完全培養(yǎng)基，C組交替使用含糖濃度為33.3mmol/L和11.1mmol/L，每24h更換一次培養(yǎng)基。在相同條件下培養(yǎng)3、5、7天后進(jìn)行MTT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力以確定實(shí)驗(yàn)高糖濃度及刺激時(shí)間。

6、
　　2.預(yù)實(shí)驗(yàn)確定艾塞那肽刺激濃度
　　在高糖濃度相同的刺激條件下，將細(xì)胞分為三組，分別使用含有濃度為50nmmol/L、100nmmol/L、150nmmol/L艾塞那肽的完全培養(yǎng)基，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天后行通過(guò)MTT檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖活力以確定艾塞那肽使用濃度。
　　3.通過(guò)MTT檢測(cè)高糖刺激及艾塞那肽對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響
　　將大鼠RIN-m5f胰島素瘤細(xì)胞分成對(duì)照組、高糖組、高糖+艾塞那肽組3組，每

7、組5個(gè)復(fù)孔，接種于96孔板，分別用含有正常糖(11.1mmol/L)、間歇性高糖（11.1mmol/L、33.3mmol/L交替使用）、間歇性高糖+艾塞那肽(100nmol/L)的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)7天后，通過(guò)MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力。
　　4.Western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)相對(duì)量
　　將RIN-m5f細(xì)胞分為對(duì)照組、高糖組、高糖+艾塞那肽組3組，分別用含有正常糖、間歇性高糖、間歇性

8、高糖+艾塞那肽的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，相同條件下連續(xù)培養(yǎng)7天后提取細(xì)胞蛋白并通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)各組細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子(CHOP、BIP)、磷酸化的c-jun氨基末端激酶(p-JNK)、凋亡分子Caspase-3的表達(dá)水平。
　　5.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況
　　將RIN-m5f細(xì)胞分為對(duì)照組、高糖組、高糖+艾塞那肽組3組，分別用含有正常糖、間歇性高糖、間歇性高糖+艾塞那肽的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞

9、培養(yǎng)，相同條件下連續(xù)培養(yǎng)7天后，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.各組細(xì)胞增殖活力用光密度（Optical density，OD）值均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差表示：對(duì)照組(0.9333±0.0451)，高糖組(0.3567±0.0252)，高糖+艾塞那肽組(0.5867±0.0153)。高糖組細(xì)胞活力較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);高糖及艾塞那肽組細(xì)胞活力較高糖組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

10、=0.0002）。
　　2.各組細(xì)胞中目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平用目的蛋白的積分光密度值（IOD值）/內(nèi)參的IOD值來(lái)表示，對(duì)照組RIN-m5f細(xì)胞中CHOP(0.0285±0.0057)、BIP(0.3840±0.0389)、p-JNK(0.4588±0.1256)、Caspase-3(0.6349±0.1256)表達(dá)水平較低;高糖組RIN-m5f細(xì)胞中CHOP(0.0686±0.0081)、BIP(0.9862±0.1577)、p

11、-JNK(2.1860±0.2356)、Caspase-3(2.3640±0.2238)表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高(p＜0.05);高糖+艾塞那肽組RIN-m5f細(xì)胞中CHOP(0.0495±0.0034)、BIP(0.3591±0.0641)、p-JNK(1.3530±0.0387)、Caspase-3(1.4210±0.3145)表達(dá)水平較高糖組則明顯降低(p＜0.05)。
　　3.與對(duì)照組(17.51％)相比，高糖組(31.2