雞柔嫩艾美耳球蟲表達序列標簽和不同發(fā)育階段基因表達譜分析.pdf

1、雞球蟲屬于具有頂復合器的原生動物，寄生于雞的腸上皮細胞內，常常引起大批雞只的死亡，因此雞球蟲病對養(yǎng)禽業(yè)的危害是巨大的。本文用球蟲的四個發(fā)育階段的樣品經反轉錄后分別與cDNA陣列進行雜交，分析了在不同發(fā)育階段中基因的表達情況，篩選出一些與發(fā)育相關的基因。 以柔嫩艾美耳球蟲敏感株和抗馬杜霉素株(由敏感株誘導)各四個發(fā)育階段即未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子為材料，構建了具有不同發(fā)育階段和具有不同表型的混合cDNA文庫。根據細

2、菌計數法推斷cDNA文庫濃度約為1.83×10<'5>個細菌/ml。文庫細菌培養(yǎng)液均勻涂布于麥康凱平板上，檢測重組率約為80％。對隨機挑選的200個cDNA克隆進行PCR擴增，獲得137個特異性擴增產物，用1％瓊脂糖電泳檢測插入片段的大小，文庫隨機插入外源cDNA片段的平均長度約為1Kb。根據對文庫的質量鑒定，能夠滿足后續(xù)分析的需要。 從這個混合文庫中隨機挑取9600個克隆進行大規(guī)模3’端測序，經生物信息學分析，獲得2806條3

3、’端高質量的表達序列標簽(ESTs)，拼接出1424個假定獨立轉錄本(TUTS)。與UniProt數據庫的BLASTx結果顯示：共1191個TUTs沒有明顯同源性而被鑒定為未知基因，約占總TUTs總數的83.6％。文庫1424個TUTs的BLASTn比對結果表明：約83.2％獨立基因(TUTs)與雞柔嫩艾美耳球蟲Houghton株基因組序列有同源性匹配(E value<10<'-5>)。根據與GenBank中dbEST數據庫中柔嫩艾美耳

4、球蟲的EST序列進行比對獲得了811個TUTS做為文庫的特有基因；共有84個TUTS與剛地弓形體的獨立基因具有同源性匹配(E值≤10<'-5>)。 在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子發(fā)育時期，共鑒定出484個特異表達的基因(P<0.01，倍數變化>2)。熒光定量PCR分析驗證了cDNA陣列數據的可靠性。經過對不同發(fā)育時期的基因表達譜分析，在未孢子化卵囊階段和孢子化卵囊階段的代謝水平要遠遠低于子孢子階段和裂殖子階段。可以推