基于柔嫩艾美耳球蟲(chóng)調(diào)控序列的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和剛地弓形蟲(chóng)的瞬間轉(zhuǎn)染.pdf

1、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)屬于頂復(fù)門(mén)寄生原蟲(chóng)，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害巨大。這就需要對(duì)它的生物學(xué)特性進(jìn)行深入的了解。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是目前研究生物學(xué)特性的有效手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)親緣關(guān)系密切的弓形蟲(chóng)和瘧原蟲(chóng)。但是由于體外培養(yǎng)困難等原因，對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的轉(zhuǎn)染仍然是個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。本實(shí)驗(yàn)中用黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白作為報(bào)告基因，對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的瞬間轉(zhuǎn)染進(jìn)行了研究。以卵囊階段提取的基因組DNA為模板，用PCR方法，分別得到了組蛋白4、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白

2、、內(nèi)膜復(fù)合物以及肌動(dòng)蛋白解聚因子的啟動(dòng)子。同時(shí)用PCR方法也得到了肌動(dòng)蛋白的下游調(diào)控序列。這樣以黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白為報(bào)告基因，其5，端和3，端分別是各個(gè)啟動(dòng)子片段和肌動(dòng)蛋白下游調(diào)控序列。構(gòu)建了pACT-YFP、pHIS-YFP、 pHIS-RFP、pTUB-YFP、pIMC-RFP和pADF-YFP表達(dá)載體。然后用構(gòu)建好的表達(dá)載體對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的子孢子階段進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件是2000V，電容25μF,Cytomix buffe

3、r為電擊介質(zhì)。電轉(zhuǎn)染后室溫靜置20分鐘后接種到MDBK細(xì)胞上，置于細(xì)胞培箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度設(shè)置為41℃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用pACT-YFP、pHIS-YFP、pHIS-RFP轉(zhuǎn)染的子孢子可在接種后19小時(shí)，可以觀察到EYFP和RFP的表達(dá)。接種后43-64小時(shí)，可觀察到表達(dá)EYFP和RFP的第一代未成熟的裂殖體；在接種后82—84小時(shí)，可觀察到表達(dá)熒光的第一代成熟的裂殖體以及釋放出的裂殖子。轉(zhuǎn)染效率為15-20個(gè)/10<'7>。對(duì)于plMC-

4、RFP和pADF-YFP，由于轉(zhuǎn)染效率較低，觀察到的表達(dá)熒光的蟲(chóng)體極少，只有2—5個(gè)/10<’7>，只觀察到處于第一代未成熟裂殖體的蟲(chóng)體。為了探討柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的調(diào)控序列能否驅(qū)動(dòng)熒光蛋白在弓形蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)，用pACT-YFP、pHIS-YFP、pTUB-YFP對(duì)弓形蟲(chóng)的速殖子階段進(jìn)行了轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件同前。轉(zhuǎn)染后的速殖子接種到MDBK細(xì)胞上，在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，在速殖子進(jìn)行分裂形成假包囊直到第二代速殖子釋放出(總共約48小時(shí))的過(guò)