柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊和子孢子差異表達基因的研究.pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳球蟲寄生于腸道所引起的一種危害嚴重的全球性寄生蟲病,給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失.目前控制球蟲病的主要方法包括化學藥物防治和疫苗免疫預防,但由于這些方法存在安全、價格以及抗藥蟲株出現(xiàn)等問題,迫切需要尋找新的防治手段來控制球蟲病.而研制高效安全的抗球蟲病基因工程疫苗和新藥物的關(guān)鍵在于尋找到重要的蟲體抗原基因.本論文以對雞危害最為嚴重的柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)為研究對象,開展了E tenella孢子生

2、殖發(fā)育階段差異表達基因的分離、鑒定等研究,為探討雞球蟲的入侵和生長發(fā)育機制,研制高效、安全的抗球蟲疫苗和新藥物奠定了重要基礎(chǔ). 1.利用抑制性消減雜交技術(shù)和cDNA微陣列技術(shù)篩選E, tenella孢子化卵囊和子孢子階段蟲體差異表達基因為了分離鑒定E. tenella孢子發(fā)育階段蟲體的差異表達基因,分別以E, tenella未孢子化卵囊和孢子化卵囊為驅(qū)動組,子孢子為實驗組;未孢子化卵囊為驅(qū)動組,孢子化卵囊為實驗組,利用抑制性消減

3、雜交(SSH)技術(shù),構(gòu)建了1個E tenella子孢子與孢子化卵囊的消減cDNA文庫(ZB),1個子孢子與未孢子化卵囊的消減cDNA文庫(ZW)和1個孢子化卵囊與未孢子化卵囊的消減cDNA文庫(BW).經(jīng)PCR鑒定,2個子孢子消減cDNA文庫的重組率都為96﹪,孢子化卵囊消減cDNA文庫的重組率為98﹪,大部分插入片段都大于500 bp.從構(gòu)建好的3個消減cDNA文庫中共挑取3004個克隆制成cDNA微陣列.芯片雜交分析后獲得1371個

4、差異表達基因克隆,其中從BW消減cDNA文庫中獲得245個,從ZB消減cDNA文庫中獲得582個,從ZW消減cDNA文庫中獲得544個.對其中727個差異表達基因克隆進行測序,結(jié)果獲得了657條有效.ESTs序列(BW文庫197條有效ESTs,ZB文庫275條,ZW文庫185條),代表118個單一基因,其中孢子化卵囊31個,子孢子87個.序列同源性搜索結(jié)果顯示:31個孢子化卵囊單一基因中,蛋白功能已知的有12個,蛋白功能未知的有19個,

5、在球蟲中已報道的有7個;87個子孢子單一基因中,蛋白功能已知的有23個,蛋白功能未知的有64個,在球蟲中已報道的有6個.從中選擇了5個差異表達基因克隆,應用實時定量PCR進行驗證,結(jié)果顯示與芯片雜交結(jié)果一致.BLASTX同源性比較分析后發(fā)現(xiàn):孢子化卵囊階段蟲體差異表達基因編碼的蛋白與E tenella微線蛋白、TA4抗原蛋白、表面抗原蛋白,剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)的熱激蛋白和蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶,人隱孢子蟲(Cryp

6、tosporidium.hominis)卵囊壁蛋白等有較高的同源性;子孢子階段蟲體高表達基因編碼的蛋白與惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、鈣依賴性蛋白激酶,約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)神經(jīng)磷脂酶C,E, tenella SERPlNl蛋白、微線蛋白、反轉(zhuǎn)錄酶等有較高的同源性.提示這些基因編碼的蛋白可能參與了卵囊孢子化的形成、蟲體的入侵、蟲體在宿主細胞內(nèi)的生長發(fā)育、蟲體與宿

7、主細胞的相互作用、細胞代謝、免疫調(diào)節(jié)及細胞信號傳導等.本研究為分析鑒定雞球蟲孢子發(fā)育階段蟲體差異表達基因,探討與雞球蟲入侵和生長發(fā)育相關(guān)基因的作用機制等奠定了基礎(chǔ). 2.E.tenella孢子化卵囊和子孢子差異表達新基因全長cDNA的克隆與分析根據(jù)差異表達基因的ESTs序列,利用RACE技術(shù)擴增獲得8個E.tenella新基因的全長cDNA,其中包括5個孢子化卵囊新基因全長cDNAs(編號為:BW1-A05、BW1-E06、BW

8、3-F04、BW3-D10、BW11-H07;Genbank登錄號:EF552212、EF552214、EF552213、EF552211、EF552218),3個子孢子新基因全長cDNAs(編號為:ZB1-A02、ZB1-A08、ZB11-A04;Genbank登錄號:EF552216、EF552217、EF552215).利用生物信息學分析軟件對新基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、抗原位點等進行了分析預測,對編碼蛋白的保守功能域、結(jié)

9、構(gòu)位點及同源性蛋白進行了搜索,結(jié)果顯示4個基因編碼的蛋白與其它頂復器原蟲蛋白有較高的同源性,其中孢子化卵囊高表達基因BW11-H07編碼的蛋白與T.gondii的假想蛋白有較高的同源性;BW1-E06基因編碼的蛋白與推測的T.gondii蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(putative PDI-like protein)有較高的同源性;子孢子階段高表達基因ZB11-A04編碼的蛋白與T.gondii 天冬氨酸蛋白酶3(toxomepsin 3)有較

10、高同源性;ZB1-A02基因編碼的蛋白與嬰兒利氏曼原蟲 (Leishmania infantum)蛋白激酶有較高的同源性;其余基因編碼的蛋白可能是E.tenellct特有的蛋白.本研究為雞球蟲候選基因工程疫苗靶分子和新治療藥物靶標的篩選提供了重要的參考依據(jù). 3.E.tenella 新基因在大腸桿菌中的表達將獲得的E.tenella差異表達新基因 (BW1-E06、BW3-F04、ZB1-A02、ZB1-A08) 全長cDNA連

11、接到原核表達載體pGEX-4T-2中,成功構(gòu)建了4個重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-E06 (4T-E06)、pGEX-4T-F04(4T-F04)、pGEX-4T-A02 (4T-A02)、pGEX-4T-A08 (4T-A08),并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功誘導表達,純化獲得4個重組融合蛋白(GST-E06、GST-F04、GST-A02、GST-A08),其中4T-E06表達的融合蛋白大部分以可溶性蛋白形式出現(xiàn),其余3個重組質(zhì)

12、粒表達的融合蛋白都以包涵體形式存在,利用GST resin成功純化了4個重組融合蛋白.Western-blot分析結(jié)果表明4個重組蛋白都具良好的抗原性.進一步深入研究這些基因以及編碼蛋白的功能,對研制雞球蟲候選疫苗和新治療藥物都具有重要意義. 4.E.tenella重組蛋白免疫保護效果的初步研究為評價本研究研制的幾種基因重組抗原在雞體中誘導的免疫保護效果,將重組表達抗原GST-E06、GST-A02、空載體pGEX-4T-2表達

13、蛋白GST分別設高(100μg)、中(50μg)、低(25μg)三個免疫劑量加弗氏佐劑肌肉免疫雞.同時將4T-E06、4T-A02、4T-A08、4T-F04重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的活菌和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的活菌分兩個劑量(150μg和300 μg)口服免疫雞.分別于7、17和27日齡三次免疫雞,31日齡時經(jīng)口攻擊感染E.tenella 2×10<'4>個卵囊/只.結(jié)果顯示:1)增重:所有免疫組雞增重量均低于不免疫不攻蟲組,重組蛋白免疫組增重最多

14、的是4T-A02(50μg)免疫組,其相對增重率為80.7﹪;口服活菌免疫組,增重較多是重組表達菌4T-A08(300μg)和4T-A02(150μg)劑量免疫組,相對增重率為83.3﹪和81.7﹪,與不免疫攻蟲組(73.2﹪)相比差異顯著(p<0.05).2)卵囊產(chǎn)量:重組蛋白免疫組卵囊產(chǎn)量最低的為4T-E06(50μg)免疫組,相對卵囊產(chǎn)量為63.6﹪;口服活菌免疫組的卵囊產(chǎn)量最低的為4T-A02(300μg)免疫組,相對卵囊產(chǎn)量為

15、66.6﹪;3)腸道病變記分:重組蛋白免疫組病變記分與不免疫攻蟲組差異不明顯,但50μg免疫劑量組的病變記分都低于不免疫攻蟲組,其中最低的免疫組為4T-A02(50μg);口服免疫組病變記分都低于不免疫攻蟲組的病變記分,其中最低的免疫組為4T-A02(300 μg),與不免疫攻蟲組差異顯著(p<0.05).深入對這些重組抗原的遞呈、免疫佐劑以及不同免疫組合等方面進行研究,同時進一步對其它孢子發(fā)育階段差異表達基因及其基因產(chǎn)物誘導對雞抗球蟲