雞柔嫩艾美耳球蟲體外模型的建立及其HSP70基因的克隆表達(dá).pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳屬的柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)等7種球蟲單獨或混合感染腸道不同部位所引起的一種腸道細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲病。 (1)本研究利用雞胚腸上皮細(xì)胞來替代雞腎細(xì)胞，建立一種新型的雞球蟲體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，因為球蟲感染腸上皮細(xì)胞的條件和過程更加接近了雞體自然感染狀態(tài)。探討了雞胚腸上皮細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法，結(jié)果顯示，雞胚腸上皮細(xì)胞，在37℃用Ⅰ型膠原酶分步消化70 min，低速離心后接種培養(yǎng)板，90 min

2、后將未貼壁的細(xì)胞移至新的有膠原鋪底的24孔培養(yǎng)板中，5％CO2 39.5℃，DMEM含5％胎牛血清的條件下培養(yǎng)，24～48 h細(xì)胞貼壁，7～8 d長成單層。 (2)收集純化的球蟲子孢子，接種于適合球蟲生長發(fā)育的雞胚腸上皮原代細(xì)胞，采用這一細(xì)胞模型探索了E.tenella裂殖生殖階段的發(fā)育情況，經(jīng)試驗確定了最適球蟲繁殖的培養(yǎng)基和添加成分，建立了艾美耳球蟲雞胚腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)株。結(jié)果表明，在細(xì)胞培養(yǎng)第8天時接種子孢子，子孢子在接種

3、2 h后基本入侵細(xì)胞。換新的培養(yǎng)液重新培養(yǎng)，每12 h觀察一次，3～4 d出現(xiàn)第一代裂殖體，5～7 d出現(xiàn)第二代裂殖體，7～8 d出現(xiàn)卵囊。該模型為球蟲有關(guān)生理生化、免疫學(xué)、疫苗制備、藥物效力試驗等方面的研究工作，以及球蟲病的防治研究開辟了新途徑。 (3)同時根據(jù)Etenella HSP70基因(GenBank Locus：Z46965.1)設(shè)計特異性引物，以RT-PCR方法擴增了E. tenella廣東株基因序列，并將其克隆至

4、表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Rosetta菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，實現(xiàn)其在宿主菌Rosetta中表達(dá)。先前表達(dá)的以pET-32aa(+)為載體的HSP70蛋白多為包涵體形式存在于菌體細(xì)胞內(nèi)，通過不斷反復(fù)摸索表達(dá)條件，更換pMAL-e2X為表達(dá)載體，獲得了可溶性的融合蛋白，并結(jié)合Amylose Resin層析獲得較高濃度的目的蛋白。同時將HSP70基因插入pcDNA-6載體中，構(gòu)建DNA疫苗表達(dá)載體，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，結(jié)果表明，H