龍須菜世代差異基因在其不同世代及不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄分析.pdf

1、龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）是一種重要的產(chǎn)瓊膠紅藻，其生活史包括一個(gè)單倍的配子體世代和兩個(gè)二倍的孢子體世代，即四分孢子體及寄生在雌配子體上的果孢子體。龍須菜的四分孢子體和雌、雄配子體在形態(tài)上是相同的，可在同一時(shí)間和空間條件下觀察到三種藻體，只有在藻體成熟后通過孢子囊、配子囊或果孢子體等特征才能區(qū)分。到目前為止，關(guān)于紅藻性別相關(guān)基因在其不同世代及不同發(fā)育階段的調(diào)控等還不清楚，相關(guān)報(bào)道很少，也不夠深入。本文擬運(yùn)

2、用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)對在之前構(gòu)建的龍須菜配子體抑制性消減雜交文庫中篩選得到的陽性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的分析及篩選驗(yàn)證，為龍須菜性別及世代發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)行初步探討，同時(shí)也為紅藻類的性別決定研究提供更多的參考。
　　研究表明，內(nèi)參基因的選擇對實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果會產(chǎn)生直接的影響。尤其是對于本實(shí)驗(yàn)所針對不同世代及發(fā)育階段的龍須菜來說，常用的一些內(nèi)參基因不一定適合。因此本論文以龍須菜雌配子體的成熟部分及未成熟部分、四分孢子體以及

3、雄配子體為實(shí)驗(yàn)材料，首先進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR內(nèi)參基因的篩選。根據(jù)geNorm和NormFinder兩種軟件對9個(gè)候選內(nèi)參基因ACT、Rubc-L、GAPDH、ITS1、18S、28S、CoI、PEB、NR在四種實(shí)驗(yàn)材料中表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)，選擇了表達(dá)最穩(wěn)定的Rubc-L基因和CoI基因作為內(nèi)參基因，對龍須菜不同性別及不同發(fā)育階段差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析。
　　為了得到在龍須菜不同世代及不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因，即

4、潛在的相關(guān)基因，本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中建立了5個(gè)龍須菜抑制性消減雜交文庫并進(jìn)行了斑點(diǎn)雜交分析和測序。本論文通過對這些SSH文庫篩選得到的1873個(gè)陽性克隆的序列進(jìn)行聚類分析，共得到了365條可用序列，其中包括118個(gè)重疊群以及247條未被聚類進(jìn)任何重疊群的單條序列。用Blast2GO在線軟件對聚類得到的序列進(jìn)行了注釋分析，對消減雜交結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步的整理和明確。由于時(shí)間關(guān)系本論文只選取了其中的8條序列進(jìn)行定量PCR分析。其中包括全部屬于雌

5、配子體庫中的4條序列，contig-3、contig-52、contig-60和7310，雄配子體庫中的3條序列，contig-35、contig-11和contig-19以及一個(gè)各庫混雜的序列contig-44。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，contig-3、contig-60、contig-52和7310的相對表達(dá)基本與SSH文庫篩選結(jié)果一致，在雌配子體中大量表達(dá)，序列7310是與發(fā)育相關(guān)的一個(gè)基因，在雌配子體中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于四分孢子體和雄配子體，

6、而在成熟與未成熟的雌配子體中沒有明顯表達(dá)差異，有可能這個(gè)序列與雌配子體細(xì)胞中早期與發(fā)育為雌性特征的表達(dá)相關(guān)。
　　981型龍須菜是選育出的耐高溫良種。經(jīng)長期的栽培發(fā)現(xiàn)其營養(yǎng)生長旺盛且不易成熟，因此不易斷折。為了探究981的該種特性與生長發(fā)育調(diào)控的關(guān)系，我們從已建立的抑制性消減雜交文庫中篩選了7個(gè)四分孢子體差異表達(dá)基因進(jìn)行進(jìn)一步的篩選分析。分析結(jié)果顯示盡管這些基因與有性生殖無關(guān)，但與生長相關(guān)的基因在981龍須菜中的高表達(dá)也證實(shí)了該良