菜粉蝶不同發(fā)育階段mRNA與miRNA轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序分析.pdf

1、菜粉蝶（Pieris rapae），鱗翅目:粉蝶科，農(nóng)業(yè)上是重要的害蟲之一，主要危害十字花科蔬菜。在基礎(chǔ)研究中，菜粉蝶及其重要天敵蝶蛹金小蜂是自體免疫的重要的相互作用模型，然而其基因組尚未測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序亦可為菜粉蝶基因表達(dá)、生物學(xué)以及防治策略提供全局性的視角。故本論文以菜粉蝶不同發(fā)育階段的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)為研究目標(biāo)，對(duì)菜粉蝶不同生長(zhǎng)發(fā)育階段構(gòu)建了六個(gè)mRNA庫(kù)和六個(gè)small RNA庫(kù)，應(yīng)用illumina測(cè)序，通過(guò)基因注釋與發(fā)育轉(zhuǎn)錄表

2、達(dá)分析，以期獲得菜粉蝶發(fā)育轉(zhuǎn)錄組并挖掘出與發(fā)育有關(guān)的基因。
　　對(duì)于mRNA序列，主要內(nèi)容包括轉(zhuǎn)錄組拼接、轉(zhuǎn)錄組注釋與發(fā)育相關(guān)基因的篩選。首先通過(guò)de novo拼接方法，生成了96,069條unigenes序列和196,202條transcripts序列，其N50和轉(zhuǎn)錄本拼接序列的平均長(zhǎng)度達(dá)到2269bp和1206bp。其中31,774（33％）條unigenes序列能顯著性比對(duì)到NCBI中非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出16500條具有

3、完整的ORF的基因序列。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示同源性序列最多的前五大物種均屬鱗翅目，表明拼接結(jié)果可靠。隨后，將注釋所得基因再次利用GO、COG/KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行深入注釋，發(fā)現(xiàn)849個(gè)基因參與到七條主要的發(fā)育通路，如Hippo、Notch與JAK2等發(fā)育關(guān)鍵基因。在基因表達(dá)水平分析中，兩兩比較菜粉蝶相鄰六個(gè)發(fā)育階段，發(fā)現(xiàn)從卵期到初孵幼蟲期的轉(zhuǎn)變基因表達(dá)水平顯著變化的基因最多；發(fā)現(xiàn)表皮蛋白基因的表達(dá)水平在菜粉蝶不同的發(fā)育階段變化尤其頻繁，共

4、有20余個(gè)表皮蛋白基因在任意的相鄰階段表達(dá)水平差異顯著，推測(cè)與菜粉蝶發(fā)育過(guò)程中的蛻皮調(diào)控機(jī)制有關(guān)；此外，在不同發(fā)育階段均鑒定到階段特異性表達(dá)的基因，這些基因可作為發(fā)育階段的分子標(biāo)簽；最后，通過(guò)對(duì)熱激蛋白同源進(jìn)化與表達(dá)共分析，顯示同源相近的Hsp基因具有相同或相近的表達(dá)模式。
　　針對(duì)smRNA序列，主要研究?jī)?nèi)容包括小RNA的比對(duì)注釋，保守與新miRNA成熟體的鑒定，miRNA前體序列的預(yù)測(cè)，與表達(dá)水平研究。篩選與質(zhì)控獲得53,50

5、8,931條序列長(zhǎng)度在18-24nt高質(zhì)量reads，去冗余后為121,695條特異序列，78,316條特異序列分別注釋到非編碼RNA數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI和Rfam）的rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA,siRNA,miRNA等序列。其中以rRNA占比最高，其次為tRNA和miRNA。初選為miRNA的序列再次比對(duì)到miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，并去除冗余后，鑒定到143條保守miRNA序列，其中54個(gè)miRNA具有前體序列。另外，鑒定到

6、21條新的成熟miRNA，其中18條含miRNA前體序列，3條pre-miRNA序列包含miRNA*。差異表達(dá)分析的結(jié)果顯示有78條成熟miRNA序列的表達(dá)水平在至少兩兩相鄰發(fā)育階段之間存在顯著性差異，且大部分出現(xiàn)在從卵期到初孵幼蟲期。
　　對(duì)于miRNA調(diào)控基因表達(dá)研究，主要內(nèi)容包括靶基因預(yù)測(cè)、篩選參與發(fā)育代謝通路的靶基因與表達(dá)相關(guān)性分析。以拼接轉(zhuǎn)錄本為參考序列，應(yīng)用RNAHybrid和miranda軟件分別預(yù)測(cè)出6,198和6

7、,959個(gè)潛在miRNA靶位點(diǎn)，涉及5,589個(gè)靶基因，這些靶基因均注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)。此外，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中與昆蟲發(fā)育相關(guān)的代謝通路以及差異表達(dá)的miRNA和靶基因表達(dá)量的高度負(fù)相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)小于-0.8）推斷出可能與菜粉蝶的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的20條miRNA序列與37個(gè)靶基因。
　　本論文通過(guò)RNA-seq技術(shù)首次獲得了對(duì)菜粉蝶發(fā)育轉(zhuǎn)錄組，這是鱗翅目昆蟲第一個(gè)非模式生物的發(fā)育轉(zhuǎn)錄組，獲得了具有完整編碼框的基因16500個(gè)，發(fā)現(xiàn)