高通量測序

1、高通量測序樣本制備,葛芹玉geqinyu@seu.edu.cn,,,高通量測序樣本準(zhǔn)備的重要性,各種不同類型的樣本基因組DNA（resequencing）宏基因組測序（也稱微生物環(huán)境基因組，或元基因組）cDNAmRNAmiRNAMethylationChIP-chipExon，Chrometc代表性問題：原始樣本的完整性與量的問題、各種偏性、誤差、各種可能的污染等等。,測序樣本制備的基本流程,樣本核酸的獲?。ㄑ?，

2、組織，細(xì)胞，血清，……）測序文庫制備DNA文庫mRNA文庫miRNA文庫片段選擇文庫編碼文庫 barcode測序模板制備乳液PCR橋式PCR滾環(huán)擴(kuò)增步驟繁瑣……,第一節(jié) 測序文庫制備,樣本核酸（DNA/cDNA）的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)DNA: 完整性 Total RNA: 完整性（Agilent） miRNAPretreatment某測序公司原始樣本需求1. 所需Total RNA的量均不少于20μg/文庫，T

3、otal RNA可以保存在DEPC處理過的水中、75%的乙醇、異丙醇中，具體以什么方式保存請注明。 2. 如提供實(shí)驗(yàn)材料為動物組織材料，樣品質(zhì)量需大于2g；3. 如提供實(shí)驗(yàn)材料為植物樣品，樣品質(zhì)量需大于4g；4. 如提供實(shí)驗(yàn)材料為培養(yǎng)細(xì)胞，請?zhí)峁?×107培養(yǎng)好的細(xì)胞；5. 如提供實(shí)驗(yàn)材料為血液樣品，請?zhí)峁?ml的樣品。,一、樣本DNA等的片段化技術(shù)1、超聲破碎技術(shù),能量水平，時(shí)間，體積等參數(shù),不足之處：體積大

4、易污染精度不夠,Covaris S-series,2010年1月5日報(bào)道——安捷倫科技公司(NYSE: A)與Covaris 公司于今日宣布了簽訂一項(xiàng)合作開發(fā)市場協(xié)議，該協(xié)議表明，未來Covaris S2 DNA剪切技術(shù)將與安捷倫 SureSelect 靶向序列捕獲系統(tǒng)一起銷售，以提高新一代測序?qū)嶒?yàn)的效率。,Covaris Adaptive Focused Acoustics? (AFA),濃度不同,長度不同,物種不同,一些比較理想的

5、結(jié)果,體會：有很大的損失不同的樣本需要不同的優(yōu)化，沒有現(xiàn)成可直接用的條件,2、片段化酶,最初是利用限制性內(nèi)切酶（Endodeoxyribonuclease）或DNA酶I（Deoxyribonuclease I）配合Mn2+將DNA大片段切割成小片段針對新一代的高通量測序平臺，已經(jīng)有多家公司開發(fā)了配套的酶切試劑，多數(shù)是利用幾種酶組合而成，其中包含一種可以在雙鏈DNA上有隨機(jī)識別位點(diǎn)的酶將雙鏈DNA制造切口，然后由另外一種酶將切口處的

6、單鏈DNA切斷形成雙鏈DNA片段Fragmentase：該片段化酶產(chǎn)品包含著兩種不同功能的酶，其一可以實(shí)現(xiàn)在DNA雙鏈分子上隨機(jī)制造切口（nick），另一種酶可以識別這種切口并且在互補(bǔ)鏈對應(yīng)處制造缺口，從而完全從該處斷開雙鏈DNA，從而實(shí)現(xiàn)只需根據(jù)反應(yīng)時(shí)間的長短獲得不同長度的DNA片段，范圍為100–800 bp DNA。不同的處理反應(yīng)時(shí)間獲得的長度有所差異，但是這種處理方法對原始樣品的需求較大，而且對于目前主流的二代測序技術(shù)而言，還

7、需要進(jìn)一步切膠選擇特定的片段，而且該商品對于不同樣品的反應(yīng)效果均一性有待進(jìn)一步驗(yàn)證,Fragmentase（NEB）,Generates dsDNA breaks in a time-dependent manner to yield 100–800 bp DNA fragments depending on reaction time.,損失相對較小集中程度不高，需要后續(xù)的片段選擇,3、HydroShear,The Hydroshe

8、ar is used for fragmenting DNA to sizes larger than 1KB.The HydroShear offers the simplest, most reproducible, and most controllable method available for generating random DNA fragments. Virtually any source of DNA at

9、any concentration in volumes as small as 40µl can be randomly fractured to within a two-fold size distribution. For instance, if your target size is 2kb, you can calibrate the HydroShear to produce a distribution ce

10、ntered on 2kb with 90% of your DNA falling between 1.3 kb and 2.6kb,HydroShear,HydroShear,我們的結(jié)果,可以實(shí)現(xiàn)自動清洗的新設(shè)備,4、霧化法（Nebulization）,DNA霧化儀的工作原理如下：高壓氮?dú)鈴捻敹藟喝?，通過兩側(cè)的進(jìn)氣道對底部的DNA緩沖液混合物產(chǎn)生壓力，液體順著中部細(xì)管上升至頂部。頂部出液口處有篩子之類的東西，DNA通過“篩子”，被打

11、成小片段。通過調(diào)節(jié)壓力大小，可以把DNA打成所需要的bp長度。在使用之前DNA必須經(jīng)過純化。,霧化法DNA片段化,通常采用的DNA溶液體系為：1μg-５μg經(jīng)純化的基因組DNA溶解于50 μL 的TE，并加入700 μL nebulization buffer。對DNA進(jìn)行霧化６分鐘，氣體壓力為32--35psi（Pounds per square inch。P是磅pound，S是平方square，I是英寸inch），霧化環(huán)境為冰浴。所

12、得的典型結(jié)果為DNA打碎至0–1200 bp，峰值為5–600 bp霧化法與更早期的酶切法相比，可重復(fù)性相對較好，并且對于所處理的DNA序列沒有選擇性，非?？焖俨⑶冶阋恕５撬玫腄NA分子片段長度的區(qū)間非常大，使得處于可用區(qū)間200 ± 20bp 的片段僅占10%左右。為了滿足新一代測序的要求，必須要選擇長度較為集中的片段，增加的純化篩選造成了樣本DNA的大量流失。這一缺點(diǎn)不僅使成本增加，而且使得痕量DNA的研究難以實(shí)現(xiàn)，

13、因而商業(yè)推廣價(jià)值較小。通量較低也是其顯著缺點(diǎn)。目前已經(jīng)基本被CovarisTM超聲儀進(jìn)行超聲打碎替代。,片段化方法比較,數(shù)字表達(dá)譜,二、Fragment Recovery（Size selection）,1、傳統(tǒng)切膠回收操作復(fù)雜專門試劑盒效率低高效試劑盒開發(fā)？,2、改進(jìn)型的凝膠回收(E-gel),7分鐘內(nèi)完成DNA分離（50bp-10kb）選擇瓊脂糖濃度為0.8%、1.2%或2%且結(jié)合有SYBR Safe或溴化乙啶DNA染料的

14、E-Gel無需紫外線即可實(shí)時(shí)顯示DNA遷移，靈敏度超高快捷簡單的DNA條帶提取適合低、中、高不同通量,3、新的儀器設(shè)備,Caliper的Labchip XT全自動DNA片段回收儀等 前期投入大耗材昂貴回收載量低,4、新的試劑—bead-based size selection,磁珠法純化試劑：可以進(jìn)行某特定片段區(qū)域的選擇E-Z 96® Mag-Bind® Oligonucleotide Purific

15、ation KitAgencourt BioscienceAMPure Beads AMPure XP Beads NEB next generation series,Agencourt AMPure XP Beads,,SPRI works Fragment Library System,Beckman Coulter has created a simplified automated workflow that util

16、izes Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) paramagnetic bead based technology to create an automated system for fragment library preparation for the Illumina Genome Analyzer.,三、End-repair,T4 DNA Polymerase（3’-5’外切

17、）E. coli DNA Polymerase I (Large (Klenow) Fragment) （5’ -3’聚合）T4 Polynucleotide Kinase（5’磷酸化 ）,四、通用接頭連接,平末端連接粘性末端連接接頭自連接問題？,Forked adaptor（illumina）,Single reads adaptor,Pair-end adaptor,DNA連接酶的作用機(jī)制,細(xì)菌的DNA連接酶以NAD為能源

18、，動物細(xì)胞和噬菌體的連接酶以ATP為能源。T4的DNA連接酶可以連接平末端。,尼克酰胺單磷酸,腺苷基,連接酶,DNA連接酶RNA連接酶,五、各種類型測序文庫的構(gòu)建,FragmentPair-endMate-pairDNA/mRNA/miRNAChIP-Seq/MeDIP-Seq/轉(zhuǎn)錄組/表達(dá)譜等等……,,,PCR Amplification,1、Fragment Library/single-read Library,單端測

19、序(Single-read)首先將DNA樣本進(jìn)行片段化處理形成200-500bp的片段，測序引物序列連接到DNA片段的一端，然后末端加上接頭，將片段固定在flow cell上生成DNA簇，上機(jī)測序單端讀取序列。,2、Paired-end library,Paired-end方法是指在構(gòu)建待測DNA文庫時(shí)在兩端的接頭上都加上測序引物結(jié)合位點(diǎn)，在第一輪測序完成后，去除第一輪測序的模板鏈，用對讀測序模塊(Paired-End Module)引

20、導(dǎo)互補(bǔ)鏈在原位置再生和擴(kuò)增，以達(dá)到第二輪測序所用的模板量，進(jìn)行第二輪互補(bǔ)鏈的合成測序(圖2)。,Mate-pair文庫制備旨在生成一些短的DNA片段，這些片段包含基因組中較大跨度(2-10 kb)片段兩端的序列，更具體地說：首先將基因組DNA隨機(jī)打斷到特定大?。?-10 kb范圍可選）；然后經(jīng)末端修復(fù)，生物素標(biāo)記和環(huán)化等實(shí)驗(yàn)步驟后，再把環(huán)化后的DNA分子打斷成400-600 bp的片段并通過帶有鏈親和霉素的磁珠把那些帶有生物素標(biāo)記的片段

21、捕獲。這些捕獲的片段再經(jīng)末端修飾和加上特定接頭后建成mate-pair文庫，然后上機(jī)測序。,3、Mate-pair Library,Mate-pair Library（ABI）,短序列測序中需要考慮拼接的問題,4、編碼文庫: barcode/Index,編碼文庫的必要性兩端編碼,Indexing (illumina),5、Small RNA library,問題解決辦法,SOLiD,illumina,改進(jìn)的miRNA測序文庫制備,6

22、、Target Capture Sequencing/ Selection library,Molecular Inversion Probe（MIP）,,靶標(biāo)富集,為了在大樣本量中充分發(fā)揮新一代測序技術(shù)的潛能，科學(xué)家們開發(fā)出幾種方法，來選擇性富集目標(biāo)區(qū)域。與全基因組測序相比，富集后再測序降低了成本，也減輕了后續(xù)數(shù)據(jù)分析的壓力，讓研究人員能夠輕松利用新一代測序的通量。目前有幾種靶向富集方法，包括分子倒置探針連接測序（MIPS）、基于寡核

23、苷酸雜交三種富集技術(shù)：羅氏NimbleGen的SeqCap寡核苷酸雜交型芯片捕獲，安捷倫的SureSelect寡核苷酸雜交溶液型捕獲以及Raindance的多重PCR方法的方法。,三種富集技術(shù)比較,為了評估這些方法在ABI SOLiD 3系統(tǒng)上表現(xiàn)如何，來自邁阿密大學(xué)米勒醫(yī)學(xué)院以及Life Technologies的研究人員評估了三種富集技術(shù)。結(jié)果發(fā)表在plos one上。對于三種方法來說，目標(biāo)區(qū)域都是相同的，大約0.8 Mb。富集

24、以及測序之后，利用幾個(gè)指標(biāo)來分析SOLiD測序結(jié)果，包括各樣品間覆蓋深度的一致性、擊中（on-target）和脫靶（off-target）效率、等位基因偏向以及與芯片數(shù)據(jù)的基因型一致性。,,安捷倫的SureSelect表現(xiàn)出優(yōu)異的擊中效率以及各樣品間讀取深度的一致性。在讀取深度為20倍及以下時(shí)，NimbleGen的性能很相似。Raindance和NimbleGen SeqCap的讀取深度都更嚴(yán)格分布在平均值左右，但擊中效率卻不如Sure

25、Select。在分析設(shè)計(jì)上，Raindance表現(xiàn)出最好的多功能性。它靶定了目標(biāo)區(qū)域的97%，這對于診斷性的重測序可能很有用。,外顯子測序轉(zhuǎn)錄組測序表達(dá)譜測序MeDIP-SeqChIP-Seq……,7、Other Sequencing Library Preparation,外顯子測序,,轉(zhuǎn)錄組測序測序,轉(zhuǎn)錄組測序可以得到特定條件下所有mRNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，從而發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本和可變剪接體基因表達(dá)譜(gene expres

26、sion profile)：指通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫,大規(guī)模cDNA測序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群體組成,從而描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息,這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因表達(dá)譜,表達(dá)譜測序,ChIP-sequencing,MeDIP-sequencing,Bisulfite Sequencing,六、文庫質(zhì)量控制,基本指標(biāo)濃度片段長度及均一度純度

27、評價(jià)方式紫外分光光度計(jì)微量定量：NanoDrop etcAgilent耗材貴Quantitative PCRSequencing analysis,Agilent 2100 Bioanalyzer,,,第二節(jié)測序模板制備技術(shù)介紹,新一代高通量測序：單分子多拷貝的獲得滾環(huán)復(fù)制乳液PCR橋式PCR單分子測序,一、滾環(huán)復(fù)制（rolling-circle amplification）,技術(shù)起源DNA復(fù)制的一種方式優(yōu)點(diǎn)

28、恒溫?cái)U(kuò)增高靈敏應(yīng)用：SNP，甲基化，生物芯片，WGA等,Complete Genomics——DNB,,2012年9月17日–中國深圳的國際領(lǐng)先基因技術(shù)公司深圳華大基因（華大基因）及人類全基因組測序的創(chuàng)新領(lǐng)導(dǎo)者Complete Genomics, Inc.（納斯達(dá)克：GNOM）（Complete），今日宣布雙方已經(jīng)達(dá)成確定性協(xié)議，華大基因在美國的全資子公司將向Complete發(fā)出現(xiàn)金收購要約，以每股3.15美元（不計(jì)利息）收購該公

29、司所有股權(quán)。該提價(jià)較Complete于2012年6月4日最后的收盤價(jià)2.04美元，高出54％的溢價(jià)。6月4日是Complete宣布開始考慮進(jìn)行戰(zhàn)略選擇以確保繼續(xù)為其醫(yī)療技術(shù)的商業(yè)化提供所需資金來源之前的最后一個(gè)交易日。,技術(shù)簡介：水包油：大部分化妝品油包水乳液聚合：反應(yīng)器生化反應(yīng)器多重PCR反應(yīng)BEAMing（bead、emulsion、amplification、magnetic）High-throughput Seq

30、uencing,二、乳液PCR,1、乳液PCR——454 sequencing,文庫制備乳液PCR玻璃纖維上進(jìn)行固定加入測序反應(yīng)需要的試劑主要是酶。1平方毫米的地方大概有480個(gè)這樣的孔,Sequencing Workflow Emulsion PCR,Sequencing WorkflowLoading of PicoTiterPlate Device,Well diameter: average of 44 µ

31、m> 400,000 reads obtained in parallelA single clonally amplified sstDNA bead is deposited per well,Depositing DNA beads into the PicoTiterPlate device,Quality filtered bases,Amplified sstDNA library beads,,,2、乳液PCR—

32、—SOLiD,乳液PCR——SOLiD,Bead Enrichment,Templated beads are separated from non-templated beads via polystyrene beads,Pre- and Post-Bead Enrichment P2-hybridization,Bead Deposition,Templated beads are modified at their 3’-en

33、d and covalently attached to a glass slide.,Slide Configurations,三、橋式PCR（Bridge PCR）,固相PCR：是將特定的引物寡核苷酸通過不同的方法共價(jià)固定在固相支持物上來擴(kuò)增目的DNA。橋式固相擴(kuò)增,橋式PCR（Bridge PCR）,Illumina 高通量測序芯片表面連接有一層單鏈引物，兩端連接測序接頭的單鏈DNA 片段通過與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)結(jié)合，引物延

34、伸成為雙鏈后，使雙鏈變性成為單鏈，該單鏈DNA 的一端就被“固定”在芯片上，而單鏈DNA 的另一端隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被“固定”住，形成“橋（bridge）”。經(jīng)過反復(fù)30 輪擴(kuò)增后，每個(gè)單分子得到了約1000 倍擴(kuò)增，成為單克隆“DNA簇”。,橋式PCR-Solexa,Isothermal amplification method for next-generation sequencing,,,,Isothermal a

35、mplification method for next-generation sequencing,,四、測序模板的固定,測序模板的固定,Template immobilization a: emulsion PCR; b: composed two basic steps: priming and extending of the single-stranded single molecule template, bridge am

36、plification occurred adjacent primers to form cluster; c: immobilization by a template; d: immobilization of a polymerase,目前高通量測樣本制備中存在的主要問題,樣本文庫制備片段化特定片段選擇文庫預(yù)擴(kuò)增等測序模板準(zhǔn)備不同的制備方法（乳液，橋式）擴(kuò)增酶的特性代表性降低！有效數(shù)據(jù)減少，甚至存在很大偏差。集成

37、化，自動化，簡單化能夠較好的解決并將成為主流方向,,,第三節(jié) 測序樣本準(zhǔn)備的自動化現(xiàn)狀,,一、樣本核酸提取自動化設(shè)備,1、新一代的磁珠系統(tǒng)——Thermo Scientifi c KingFisher Flex,在15-30min內(nèi)純化96個(gè)樣品；通過KingFisher系統(tǒng)的自動平行樣品處理，樣品之間的交叉污染和試劑浪費(fèi)現(xiàn)象被有效消除；KingFisher Flex可與包括機(jī)械臂(Robotics)，液體處理系統(tǒng)(Liquid Han

38、dling)等在內(nèi)的自動化設(shè)備聯(lián)用，進(jìn)一步增加KingFisher Flex的處理通量，滿足高通量實(shí)驗(yàn)的需求。,KingFisher技術(shù),KingFisher系列產(chǎn)品是適于分離DNA/RNA、蛋白和細(xì)胞的全自動提取純化系統(tǒng)，專為解決客戶現(xiàn)在和未來的所有純化問題而設(shè)計(jì)。創(chuàng)新的產(chǎn)品基于專利的KingFisher技術(shù)(專利號US 6447729, US 6448092)，通過特制的磁棒吸附、轉(zhuǎn)移和釋放磁珠，從而實(shí)現(xiàn)磁珠/樣品的轉(zhuǎn)移，避免了液體

39、處理過程，提高了自動化程度。KingFisher技術(shù)的工作原理如下圖所示，樣品、溶液和磁珠置于微孔板或管中，磁棒表面套有專門的磁套用于保護(hù)磁棒避免與樣品/溶液/磁珠直接接觸。,2、QIAGEN的QIAcube,QIAcube：將離心柱的操作自動化,QIAcube,二、安捷倫 2200TapeStation自動化電泳系統(tǒng),安捷倫科技公司今日發(fā)布了安捷倫 2200 TapeStation自動化電泳系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)新一代測序流程中樣品和文庫質(zhì)量控

40、制的自動化。2200 TapeStation配合預(yù)包裝的即用型 ScreenTape 試劑耗材，能夠簡化和加快新一代測序工作流程中的質(zhì)量控制。安捷倫 2200 TapeStation 兼容 16 聯(lián)條式樣品卡和 96 孔板，是一款能夠快捷測定生物樣品質(zhì)量的臺式自動化系統(tǒng)?？蛻糁恍韬唵蔚貙悠泛?ScreenTape 消耗品載入一體式 2200 TapeStation 儀器中，每個(gè)樣品僅需約 1 分鐘即可輕松獲得蛋白質(zhì)、RNA 和 DN

41、A 樣品的完整分析結(jié)果。安捷倫還提供業(yè)內(nèi)一流的用于新一代測序的 SureSelect 靶向序列捕獲系統(tǒng)，它是溶液型雜交捕獲技術(shù)，由安捷倫與麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)博德研究所最先研發(fā)成功。與安捷倫 2200 TapeStation 系統(tǒng)類似，SureSelect能夠簡化新一代測序的工作流程，便于研究人員僅對感興趣的基因組區(qū)域進(jìn)行測序,安捷倫 2200 TapeStation自動化電泳系統(tǒng),Agilent 2100 Bioanalyzer,

42、樣本核酸質(zhì)控片段選擇純化測序文庫質(zhì)控,三、相關(guān)自動化處理模塊1、Tecan Freedom EVO（75，100，150，200）,,實(shí)現(xiàn)全自動Freedom EVP 150大型平臺的高通量方案(一次性處理1-96個(gè)樣本)片斷化文庫的制備工作。Tecan公司的高通量測序樣本制備解決方案集成了包括類似Covaris自適應(yīng)聚焦超聲DNA剪切斷片化設(shè)備在內(nèi)的樣本制備過程所需的各種模塊，從而實(shí)現(xiàn)高度重現(xiàn)的全自動樣本制備。全自動的樣本制

43、備不僅節(jié)約了研究人員用于高通量測序前的樣本準(zhǔn)備時(shí)間，也完全排除了因?yàn)槭止げ僮鞫赡軐?dǎo)致的人為錯(cuò)誤或誤差，在大幅度提高處理通量的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了高度可重復(fù)的樣本制備過程，并確保了測序結(jié)果的再現(xiàn)性與可靠性。,2、安捷倫Bravo自動化液體處理平臺,安捷倫Bravo自動化液體處理平臺,3、高通量PCR純化自動化流程,4、Broad研究所富集文庫的自動化工作流程,5、VERSA下一代基因測序工作站,基于NGS技術(shù)的自動化基因文庫建立，無人值守。

44、自動化核酸提取，反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)體系建立。 兼容第三方試劑盒和試劑，減少試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)消耗。 可靈活更換液體處理頭，輕松實(shí)現(xiàn)96樣本同時(shí)處理,單通道/8通道液體處理模塊： 覆蓋不同液體處理范圍。 液體感應(yīng)功能： 減少液體消耗，提高樣品回收率。 試劑噴加功能： 節(jié)省Tips消耗和反應(yīng)準(zhǔn)備時(shí)間。 溫控盤位：快速、準(zhǔn)確的溫控功能滿足反應(yīng)中酶效率的高效發(fā)揮。 體積?。?可內(nèi)置于生物安全柜或配備相應(yīng)的UV/ Hepa過濾罩。,四、SOLi

45、D平臺的自動化設(shè)備現(xiàn)狀,A semi-automated solution for DNA fragment library preparation,Template preparation,(SOLiD),Preparation,Emulsion PCR,Beads Enrichment,五、集成化的思路,SPRIworks Fragment Library System I,六、發(fā)展方向,高通量測序發(fā)展方向?qū)ｉT化小型化樣本制備

46、的限制及發(fā)展方向集成化快速，簡化步驟，新方法，新思路？低成本準(zhǔn)確度，代表性需要標(biāo)準(zhǔn)化，但難統(tǒng)一！,DNA片段化的集成：利用微玻璃微腔里的諧振能量進(jìn)行片段化。樣本文庫的集成化儀器設(shè)備：片段化——長度選擇——接頭連接——純化（電泳凝膠棒）微量核酸樣本的測序——大家都在關(guān)注卻還沒有很好的解決的問題血清/血漿,唾液,尿液等DNA、RNA的提取純化，文庫制備質(zhì)量等,部分集成化,全部自動化,專門的整合平臺,,,,謝謝！,,,,A