應(yīng)用高通量測(cè)序研究?jī)和合到y(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制.pdf

1、研究目的：
　　 范可尼貧血是一種罕見的遺傳性疾病,臨床特征是造血功能衰竭,多發(fā)性先天畸形,易患惡性腫瘤,患者細(xì)胞對(duì)DNA交聯(lián)劑如絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)異常敏感。目前已發(fā)現(xiàn)15個(gè)FA易感基因,均參與維持基因組穩(wěn)定性功能途徑。但1/3患者沒有已知FA易感基因變異,而基因敲除小鼠模型并沒有明顯的FA疾病表型,暗示FA存在新的易感基因以及可能是多基因協(xié)同遺傳疾病。本實(shí)驗(yàn)主要研究范可尼貧血易感基因突變和闡明基因之間

2、的協(xié)同作用機(jī)制與骨髓造血衰竭發(fā)生的關(guān)系。
　　 研究方法：
　　 采用Illumina HiSeq2000測(cè)序儀,對(duì)臨床確診的5例范可尼貧血患者及其父母進(jìn)行雙末端50×全外顯子組測(cè)序,運(yùn)用生物信息學(xué)手段分析全外顯子組點(diǎn)突變、插入、缺失,通過與人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)范可尼貧血患者易感基因的突變,通過與父母外顯子組序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育過程中新發(fā)的基因突變。將高通量測(cè)序與傳統(tǒng)分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、動(dòng)物模型等研究相結(jié)

3、合,最終闡明基因之間的協(xié)同作用機(jī)制與骨髓造血衰竭發(fā)生的關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 5例患者經(jīng)臨床表現(xiàn)、外周血彗星實(shí)驗(yàn)、MMC實(shí)驗(yàn)確診為范可尼貧血。通過對(duì)5例患者全外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)每一例患者在已知的15種范可尼貧血易感基因上都有單基因或多基因突變,突變類型包括單堿基突變(錯(cuò)義突變和無義突變)或插入缺失(移碼突變),單堿基突變包括純合突變、雜合突變、復(fù)合雜合突變(一條基因上有多個(gè)突變位點(diǎn)),造成蛋白翻譯錯(cuò)誤或終止

4、。FA易感基因的突變類型及方式各不相同,突變數(shù)目不一,與臨床表現(xiàn)及嚴(yán)重程度沒有相關(guān)性,推測(cè)易感基因突變引起引起FA的機(jī)制是復(fù)雜的。如患者WFY在多個(gè)FA相關(guān)基因發(fā)生突變,在FANCA和BRCA2基因上發(fā)生了純合突變,在FANM基因發(fā)現(xiàn)符合雜合突變。而患者WSW僅在FANCA基因發(fā)現(xiàn)雜合的GG堿基缺失,引起移碼突變,通過與父母的外顯子數(shù)據(jù)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因突變來自于父親,但其父親沒有FA臨床表現(xiàn),推測(cè)其有未知的基因突變。除FA易感基因外

5、,通過與數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列進(jìn)行比對(duì),并除去由父母中遺傳到的SNP,每例患者均發(fā)現(xiàn)137-170個(gè)新發(fā)的基因突變,某些基因突變?yōu)槎鄠€(gè)患者所共有,因此FA患者因DNA交聯(lián)修復(fù)缺陷在后天發(fā)育成長(zhǎng)過程中不斷累積突變。通過KEGG網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)范可尼貧血突變基因不僅涉及各種合成代謝通路、凋亡通路、泛素化通路,而且與多條信號(hào)通路相關(guān):鈣離子信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通、MA