五齡柞蠶后部絲腺差異表達蛋白研究.pdf

1、柞蠶是一種典型的野蠶，其絲腺能夠合成和分泌絲蛋白。在五齡期，柞蠶幼蟲大量合成和分泌絲素蛋白，后部絲腺的亞細胞結構和新陳代謝也發(fā)生了很大的變化。為研究差異表達蛋白在絲素蛋白準備和合成過程中所起的作用，本文通過雙向電泳和質譜的方法分離和鑒定了五齡柞蠶幼蟲絲腺中表達量上調的蛋白，并通過實時定量PCR檢測了其中兩個蛋白的RNA表達變化。 ⑴為得到較高分辨率的蛋白電泳圖譜，實驗通過優(yōu)化，選用兩步提取法提取柞蠶絲腺組織蛋白，將水溶性蛋白和微

2、溶或不溶的蛋白分開，防止高豐度蛋白對雙向電泳的影響；并用2Dclean-up試劑盒對蛋白溶液進行了預處理，減少了橫條紋。 ⑵實驗采用載體兩性電解質進行等點聚焦，建立了一套簡單經濟的雙向電泳方法，并對柞蠶絲腺蛋白雙向電泳的條件進行了優(yōu)化，得到此系統(tǒng)的最佳上樣量為：30μg；最佳pH范圍：pH4～7；最佳聚焦條件：1000V，3h。通過和五齡一天柞蠶絲腺蛋白的雙向電泳圖譜相比較發(fā)現(xiàn)：在五齡四天時蛋白表達有較大的差異。 ⑶采用

3、IPG固化膠條進行雙向電泳，得到了分辨率較高的五齡一天和四天柞蠶絲腺蛋白雙向電泳圖譜，每張圖譜檢測到大約350個蛋白點。通過Imagemaster軟件進行比對分析，選取了23個在五齡四天特異表達或表達量上調兩倍以上的蛋白進行MALDI-TOF-MS鑒定，得到了7個已知蛋白，這些蛋白在轉錄、翻譯和細胞新陳代謝中起著重要的作用。實驗對其中的兩個蛋白基因(谷胱甘肽硫轉移酶和核糖體蛋白L8)進行了克隆，獲得了Genbank登錄號為EU54149