柞蠶脂肪酶相關(guān)蛋白(ApLSP)的表達(dá)模式和活性分析.pdf

1、脂肪酶是自然界中無(wú)處不在的酶,在脂肪代謝中催化三酰甘油水解成游離脂肪酸和甘油的過(guò)程中有重要作用。但目前關(guān)于昆蟲(chóng)脂肪酶的報(bào)道是很少的。脂肪酶一種絲氨酸水解酶，有由絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸和組氨酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域。我們主要研究了柞蠶脂肪酶相關(guān)蛋白（Lipase-related protein，ApLSP）在柞蠶體內(nèi)的的表達(dá)模式和體外的酶活活性特點(diǎn)。
　　本文通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)克隆出1032bp的開(kāi)放閱讀框并成功構(gòu)建了原

2、核表達(dá)載體 pET-28a-ApLSP，后經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 BL21（DE3）后用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)成熟的目的蛋白分子量大小為40.2 kDa，和預(yù)測(cè)的分子量一致，表明ApLSP蛋白成功表達(dá)。在變性條件下利用Ni-NTA親和層析純化對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，獲得了高純度的目的蛋白，以此蛋白免疫新西蘭大白兔獲得抗ApLSP多克隆抗體，并用于后續(xù)的功能分析。
　　利用實(shí)時(shí)定量P

3、CR和Western Blot的方法對(duì)5齡第3天柞蠶幼蟲(chóng)的各組織(表皮、絲腺、脂肪體、中腸、馬氏管和血細(xì)胞)中ApLSP基因和蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明ApLSP基因在所有檢測(cè)的組織中都有表達(dá)，且在中腸高表達(dá)。Western Blot結(jié)果表明ApLSP蛋白在所檢測(cè)的組織中分布不同于A(yíng)pLSP基因在組織中的分布，ApLSP蛋白于只在馬氏管中被檢測(cè)到。
　　選取5齡第3天的柞蠶幼蟲(chóng)分別注射熱滅活大腸桿菌(Esche

4、richia coli)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、白僵菌(Beauveria bassiana)、核型多角體病毒(nuclear polyhedrosis virus)四種病原微生物進(jìn)行免疫刺激，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)中腸中ApLSP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和Western Blot檢測(cè)馬氏管中ApLSP的蛋白表達(dá)情況。與注射 PBS對(duì)照相比較，結(jié)果表明四種病原微生物的免疫刺激都能顯著的上調(diào)或下調(diào)ApLSP mRNA和

5、蛋白水平的表達(dá)，但是上調(diào)或下調(diào)的時(shí)間和程度都不同。
　　利用表達(dá)純化的ApLSP蛋白檢測(cè)其體外酶活活性及金屬離子、抑制劑和表面活性對(duì)其活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ApLSP蛋白的最適溫度和最適 pH為35℃和8。Mg2+, Na+, Ca2+和 b-mercaptoethanol可以增強(qiáng)ApLSP酶活性，和對(duì)照相比，酶活性受到 Zn2+, Cu2+和 Fe3+的抑制。表面活性劑（SDS, glycerol和Tween-20）將酶活性