家蠶絲腺特異表達的bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bmsage和Bmdimm的功能研究.pdf

1、家蠶絲腺是一種高度特異化的器官，能夠高效特異地合成絲蛋白，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可以分為前部、中部和后部絲腺。前部絲腺不合成蛋白，中部絲腺合成絲膠蛋白，后部絲腺合成絲素蛋白，絲素蛋白分為絲素重鏈蛋白（fib-H）、絲素輕鏈蛋白(fib-L)和P25蛋白，它們按6∶6∶1組合形成多聚體蛋白。在幼蟲各齡眠期和變態(tài)期，家蠶只合成少量或不合成絲蛋白，進入五齡盛食期，絲素和絲膠基因的轉(zhuǎn)錄水平大大提高，絲蛋白隨即被大量合成。研究表明，絲蛋白基因的表達主要是在轉(zhuǎn)

2、錄調(diào)控水平進行的，目前研究學(xué)者已經(jīng)在家蠶絲腺中發(fā)現(xiàn)了大量的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子廣泛的參與絲腺器官的發(fā)育、絲蛋白基因的轉(zhuǎn)錄以及絲腺細胞的凋亡等生命過程。家蠶基因組數(shù)據(jù)和基因芯片數(shù)據(jù)的公布，為研究家蠶絲腺特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子提供了信息平臺。本研究根據(jù)之前發(fā)現(xiàn)的兩個在家蠶絲腺特異表達的并且含有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子—Bmsage和Bmdimm，采用克隆、表達、RT-PCR、western blot等技術(shù)對Bmsage和Bmdimm生物進化關(guān)系

3、、轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白質(zhì)水平的組織表達模式進行了分析和研究。同時，在細胞水平探討了它們在絲素重鏈蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用并且從分子生物學(xué)水平探討了保幼激素在家蠶絲蛋白合成過程中的作用，獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.家蠶Bmsage和Bmdimm原核表達及表達模式分析
　　進化分析發(fā)現(xiàn)，Bmsage同果蠅sage和小鼠Mesp等因子具有較高的相似性;Bmdimm同果蠅dimmed和小鼠Mist等因子具有較高的相似性。因此，我

4、們認為Bmsage屬于bHLH家族中的Mesp亞家族;而Bmdimm則同Mist因子一樣屬于Atonal亞家族。另外，將其克隆并原核表達了Bmsage和Bmdimm重組蛋白，其中Bmsage在37℃溫度下以包涵體形式表達，Bmdimm全長在該表達系統(tǒng)下不表達。對Bmdimm進行多種方式的截斷，發(fā)現(xiàn)第一種截短形式(187-636 aa)的蛋白以可溶蛋白形式在上清表達。通過各種蛋白柱的分離純化，獲得Bmsage和Bmdimm的純化蛋白。用這

5、兩個純化蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，效價均達到了512 k而且純度均在95％以上，表明可以用于后續(xù)相關(guān)實驗。組織表達分析表明:在轉(zhuǎn)錄水平上，Bmsage和Bmdimm在家蠶絲腺組織中表達，Bmdimm在中腸中存在少量表達，這與家蠶芯片表達譜分析的數(shù)據(jù)基本一致。進一步分析發(fā)現(xiàn)在前部、中部和后部絲腺中均能檢測到Bmsage和Bmdimm的轉(zhuǎn)錄本存在;在蛋白質(zhì)水平上，Bmsage和Bmdimm只存在于絲腺組織中，而且只在中部和后部絲腺

6、，其中Bmdimm在后部絲腺的量明顯高于中部絲腺。不同時期RT-PCR分析表明，Bmsage和Bmdimm的表達從四眠中后期開始逐漸升高，到五齡6-7天達到最高，隨后到成熟期表達逐漸降低直到化蛹表達終止，這一表達模式與絲素重鏈基因(fib-H)相似。通過對低絲量品種大造和高絲量品種872絲腺中Bmsage、Bmdimm和fib-H的轉(zhuǎn)錄本qRT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，Bmsage和Bmdimm基因在872的后部絲腺表達量顯著高于大造，而且

7、Bmdimm基因在后部絲腺表達量同樣高于中部絲腺，而872品種后部絲腺中fib-H的轉(zhuǎn)錄本約是大造的3倍，結(jié)果表明Bmsage和Bmdimm極有可能參與fib-H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　2.Bmsage對家蠶絲素重鏈基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　轉(zhuǎn)錄因子一般是協(xié)同其它因子對下游靶標基因的表達進行調(diào)控。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，家蠶絲腺fork head因子SGF1和Bmsage一樣均在家蠶中部和后部絲腺表達，為證實Bmsage是

8、否與SGF1存在相互作用，利用體外重組蛋白進行了far-western blot和ELISA實驗，結(jié)果表明，Bmsage能夠在體外與SGF1相互作用。為進一步驗證該結(jié)果，在家蠶胚胎細胞系中進行了免疫熒光和免疫共沉淀(co-IP)實驗，結(jié)果顯示與體外實驗一致，表明Bmsage和SGF1能夠相互作用。凝膠阻滯實驗(EMSA)結(jié)果顯示，重組表達的Bmsage和SGF1蛋白在體外孵育后，通過SGF1結(jié)合到fib-H啟動子上的近端區(qū)A和B位點上。

9、fib-H啟動子缺失實驗表明A和B位點是SGF1對fib-H的表達調(diào)控位點，這些表明Bmsage和SGF1蛋白形成復(fù)合物，通過SGF1結(jié)合到A和B位點上調(diào)控fib-H的表達。
　　3.Bmdimm對家蠶絲素重鏈基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　為分析fib-H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫下載其轉(zhuǎn)錄起始位點上游約1000 bp區(qū)域，預(yù)測分析顯示這段啟動子區(qū)域中除了存在近端區(qū)和遠端區(qū)的A、B、C、D和E位點外，還存在著E-box、

10、βFTZ-F1和POU等轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(ChIP)結(jié)果顯示，Bmdimm能夠與fib-H啟動子區(qū)域中的E-box(CAAATG)元件結(jié)合，EMSA實驗進一步驗證了該結(jié)果。Bmdimm除了與CAAATG元件結(jié)合外還可以與其它幾種形式的E-box結(jié)合，如CAATTG、CAACTG等，這表明Bmdimm結(jié)合位點并不是唯一的，暗示著可能參與其它基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如fib-L和P25等。定點突變實驗結(jié)果顯示Bmdimm堿性區(qū)域保

11、守的第113位精氨酸是結(jié)合CAAATG元件的關(guān)鍵位點。啟動子缺失實驗顯示，缺失了該E-box位點的fib-H啟動子在過表達Bmdimm后的活性幾乎沒有變化而正常的啟動子活性顯著增加，表明Bmdimm可以通過該E-box位點調(diào)控fib-H基因的表達。bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以通過其bHLH結(jié)構(gòu)域相互作用形成同源或異源二聚體，然后通過二聚體中的一段保守堿性區(qū)域與特定的DNA序列進行結(jié)合進而調(diào)控靶標基因的表達。為證實Bmdimm是否與Bmsage存

12、在相互作用，利用體外重組蛋白進行了far-westem blot和ELISA實驗，結(jié)果表明，Bmdimm在體外能夠與Bmsage相互作用。為進一步驗證該結(jié)果，在家蠶胚胎細胞系中進行了免疫熒光和co-IP實驗，結(jié)果顯示與體外實驗一致，表明Bmdimm和Bmsage能夠相互作用。為了分析Bmdimm的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測分析了Bmdimm基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游約2000 bp的啟動子區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在fork head可能的反應(yīng)元件，暗示SGF1在

13、Bmdimm基因的表達中可能起著調(diào)控作用。EMSA實驗表明SGF1可以與fork head元件結(jié)合，同時在細胞中過表達SGF1后，Bmdimm啟動子活性明顯升高，而且qRT-PCR結(jié)果顯示Bmdimm在細胞中的表達量也明顯提高。
　　4.保幼激素對家蠶絲素基因的調(diào)控
　　通過對Bmdimm基因啟動子預(yù)測得到多個與昆蟲激素相關(guān)的可能反應(yīng)元件，包括Kr，E-box，BR-C，E74A和FTZ-F1，這些元件已被證實可能是昆蟲激素

14、信號傳導(dǎo)途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件，調(diào)控下游目的基因的表達，尤其Kr位點是保幼激素早期響應(yīng)基因Kr-h1的潛在結(jié)合元件，暗示著Bmdimm基因可能受到保幼激素信號途徑的調(diào)控作用。用保幼激素類似物(JHA)處理五齡早期家蠶發(fā)現(xiàn)，家蠶五齡齡期經(jīng)過延長2-3天;qRT-PCR結(jié)果顯示與對照相比fib-H基因及其調(diào)控因子Bmdimm基因的表達量在前期有所下降，隨著齡期發(fā)育逐漸升高，并出現(xiàn)延時表達。同時發(fā)現(xiàn)，JH早期反應(yīng)基因BmKr-h1在前

15、期表達量升高，隨后隨著JH受體表達降低而降低，到五齡末期也出現(xiàn)延時表達。絲腺體外培養(yǎng)結(jié)果顯示BmKr-h1的表達趨勢與Bmdimm類似。在家蠶BmE細胞系中，用不同濃度的JHA誘導(dǎo)不同時間發(fā)現(xiàn)Bmdimm具有JH濃度和誘導(dǎo)時間依賴性。BmKr-h1位于JH受體BmMet2的下游響應(yīng)JH的誘導(dǎo)表達，而且過表達BmKr-h1后Bmdimm的表達量提高而蛻皮激素初級反應(yīng)基因Brc-Z2和Brc-Z4的表達受到抑制，表明在家蠶細胞系中存在激素信