家蠶絲腺中蛋白酶抑制劑的鑒定和功能研究.pdf

1、家蠶是一種鱗翅目昆蟲，由于可以吐絲結(jié)繭而被人類馴化。在上個(gè)世紀(jì)初，家蠶作為一種模式生物，為經(jīng)典遺傳學(xué)和生物基礎(chǔ)科學(xué)的發(fā)展作出了重大貢獻(xiàn)。目前，家蠶作為鱗翅目模式昆蟲，成為了遺傳學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和基因組學(xué)等生物學(xué)科的重要研究對象。
　　家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，其合成和分泌絲蛋白的效率非常高。家蠶泌絲機(jī)制的研究也成為了研究熱點(diǎn)。絲腺是家蠶唯一的吐絲器官，從形態(tài)和功能上可以分為三個(gè)部分:前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺。

2、后部絲腺合成和分泌的絲素蛋白流經(jīng)中部絲腺后被絲膠蛋白包裹，最后通過細(xì)長的前部絲腺管腔分泌到體外。在各種因素的綜合作用下，絲素蛋白的構(gòu)象發(fā)生了巨大的轉(zhuǎn)變，形成了不溶于水的絲纖維。目前，家蠶絲纖維作為一種天然的高分子材料主要應(yīng)用于紡織業(yè)，但是其在生物醫(yī)學(xué)材料、化妝、保健等領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛。
　　家蠶能夠在常溫常壓下高效地生產(chǎn)絲纖維，這與絲蛋白在絲腺中復(fù)雜的加工過程有關(guān)。眾多的研究已經(jīng)揭示，絲腺中離子成分與含量的變化與絲蛋白構(gòu)象的

3、變化相關(guān)。但是，這些研究仍只如管中窺豹，不足以揭示家蠶絲腺中絲纖維形成的整體過程。自從2004年家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫向全世界公開以來，家蠶的研究就進(jìn)入了大數(shù)據(jù)時(shí)代。針對發(fā)育、免疫及絲蛋白合成等家蠶的重要生物學(xué)性狀，研究者們從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方面進(jìn)行了大量的分析和梳理工作，希望能夠從中找到一些復(fù)雜的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)新的重要的信號通路。
　　絲纖維形成的過程即是絲蛋白構(gòu)象的變化過程。絲腺腔中除了絲蛋白以外的其它蛋白必然在

4、這個(gè)過程中起重要的作用，但到目前為止仍然沒有人研究絲腺腔內(nèi)究竟存在哪些蛋白以及它們所發(fā)揮的功能。因此，本研究提取了絲腺腔內(nèi)的蛋白質(zhì)，進(jìn)行了高分辨率的shotgun LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)分析，為了揭示絲腺腔內(nèi)的蛋白質(zhì)的去向，我們也對蠶絲中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定，然后對鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的功能注釋和定量分析。LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，絲腺腔內(nèi)容物和蠶絲纖維中的蛋白酶抑制劑含量都很高。因此，我們重點(diǎn)分析了絲腺和蠶絲中蛋白

5、酶抑制劑的結(jié)構(gòu)特征和分類，測定了它們的活性，并純化獲得了含量較高的幾個(gè)蛋白酶抑制劑。本研究重點(diǎn)對絲腺中Serpin類絲氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行了功能研究。由于我們制備的Serpin16抗體能識別三個(gè)高度同源的蛋白質(zhì):Serpin16、Serpin18和Serpin22，因此我們對這三個(gè)Serpin在不同發(fā)育時(shí)期和不同區(qū)段絲腺中的變化進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，測定了它們對多種蛋白酶的抑制作用，并證實(shí)了其與一種家蠶絲腺分泌的蛋白酶Bmsp82有相互作用

6、。
　　本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.絲腺腔內(nèi)容物和蠶絲的shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　(1)絲腺腔內(nèi)容物蛋白質(zhì)的鑒定和定量分析:我們收集了兩個(gè)時(shí)期的5個(gè)區(qū)段的絲腺腔內(nèi)容物樣品，通過LC-MS/MS鑒定到了1271個(gè)蛋白質(zhì)。通過GO分類注釋，可以將鑒定到的所有蛋白質(zhì)歸類于11個(gè)功能分類。利用iBAQ法進(jìn)行非標(biāo)定量分析，發(fā)現(xiàn)絲腺腔內(nèi)胞外蛋白的種類雖然少，但是豐度遠(yuǎn)高于胞內(nèi)蛋白。絲素和絲膠是絲腺腔內(nèi)豐度最高的蛋白

7、成分，從5齡第5天到上蔟第1天，3種絲素和絲膠1從中部絲腺中區(qū)和后區(qū)流向了前部絲腺和中部絲腺前區(qū);絲膠2和絲膠3都分布于前部絲腺和中部絲腺前區(qū)腺腔內(nèi)，但絲膠2下調(diào)而絲膠卻3上調(diào)。其它豐度較高的蛋白質(zhì)還有代謝相關(guān)蛋白、蛋白酶抑制劑和未知功能蛋白。從5齡第5天到上蔟第1天，在前部絲腺和中部絲腺前區(qū)腺腔內(nèi)的代謝相關(guān)的酶類顯著下調(diào)，表明在這兩段絲腺腔內(nèi)的生化反應(yīng)發(fā)生了顯著的變化。
　　(2)蠶絲中蛋白質(zhì)的鑒定和定量分析:對蠶絲樣品進(jìn)行LC

8、-MS/MS分析，共鑒定到500個(gè)蛋白質(zhì)。通過綜合分析GO分類注釋，我們將鑒定到的蠶絲蛋白質(zhì)分為了8個(gè)功能分類。通過計(jì)算各個(gè)功能分類下蛋白質(zhì)的分子豐度比例，發(fā)現(xiàn)絲素和絲膠蛋白、未知功能蛋白和蛋白酶抑制劑構(gòu)成了蠶絲中三個(gè)主要的蛋白分類，其中絲素和絲膠蛋白在7種蠶絲中的分子含量為46.2％～74.7％。相對于蛋白質(zhì)的分子含量，蛋白質(zhì)的質(zhì)量含量更真實(shí)地體現(xiàn)了其在樣品中的豐度，由于絲素和絲膠蛋白的分子量(100 kDa～400 kDa)比一般蛋

9、白質(zhì)的分子量更高，因此，絲素和絲膠蛋白的相對質(zhì)量含量顯然要比其相對分子數(shù)含量所反映的數(shù)值更高，占各種蠶絲蛋白總質(zhì)量的84.6％～96.7％。
　　2.絲腺腔和蠶絲中蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與活性分析
　　(1)絲腺腔內(nèi)容物和蠶絲中蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)分析:家蠶絲腺腔內(nèi)容物和蠶絲中的蛋白酶抑制劑有51個(gè)，根據(jù)所含的不同結(jié)構(gòu)域可以分為13類:Serpin、TIL、Kunitz_ BPTI、Kazal、amfpi、WAP、Pacifast

10、in、PBP、 A2M、 Inhibitor_ I29、Inhibitor_ I68、Cystatin和proteasome inhibitor。前9類屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，其中的6類（TIL、Kunitz BPTI、Kazal、amfpi、WAP和Pacifastin）屬于經(jīng)典類絲氨酸蛋白酶抑制劑，因?yàn)樗鼈冇蓄愃频慕Y(jié)構(gòu)和抑制機(jī)制。經(jīng)典類絲氨酸蛋白酶抑制劑都富含半胱氨酸，能形成分子內(nèi)的多對二硫鍵，具有異常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并且也常常包含多個(gè)

11、串聯(lián)的結(jié)構(gòu)域，使得抑制效率成倍地增加。
　　(2)絲腺腔內(nèi)容物和蠶絲中蛋白酶抑制劑的活性分析:通過預(yù)測活性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)絲腺分泌的蛋白酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑、胰凝乳蛋白酶抑制劑、彈性蛋白酶抑制劑和枯草桿菌蛋白酶抑制劑等。具有串聯(lián)結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑由于有多個(gè)活性位點(diǎn)，因此具有抑制多種蛋白酶活性的潛力。利用5種商品化的蛋白酶作為靶酶，我們測定了蠶繭絲中蛋白酶抑制劑的活性和特異性，結(jié)果表明繭中存在大量的蛋白酶K抑制劑和少量的胰蛋白酶抑

12、制劑，但不存在或者存在微量的胰凝乳蛋白酶抑制劑、彈性蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑。細(xì)菌和真菌等微生物都能分泌枯草桿菌蛋白酶（例如蛋白酶K）來消化宿主的蛋白質(zhì)，從而攝取營養(yǎng)和入侵其它生物。因此，蠶繭絲中大量存在的蛋白酶K抑制劑可能起到防御微生物的作用。
　　(3)蠶絲中蛋白酶抑制劑的純化:利用制備的胰蛋白酶親和柱對提取的蠶繭絲蛋白進(jìn)行親和層析，我們純化到兩個(gè)胰蛋白酶抑制劑，其分子量分別為15 kDa和13 kDa，因此將其命名

13、為TI15和TI13。質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)TI15是Kunitz家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑BmSPI51，但無法鑒定出TI13。利用制備的蛋白酶K親和柱對提取的蠶繭絲蛋白進(jìn)行親和層析，我們純化到一個(gè)分子量約30 kDa的蛋白酶K抑制劑，將其命名為KI30。雖然沒有得到可信的質(zhì)譜鑒定結(jié)果，但是Western blot的結(jié)果顯示出BmSPI39抗體與KI30蛋白有明顯的雜交信號，表明KI30為TIL家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可能為BmSPI39或者是

14、與其高度同源的蛋白。非標(biāo)定量結(jié)果表明，BmSPI51和BmSPI39是蠶繭絲中含量最高的兩個(gè)蛋白酶抑制劑，暗示KI30是BmSPI39的可能性很高。BmSPI51和BmSPI39都屬于經(jīng)典類的絲氨酸蛋白酶抑制劑，之前的研究認(rèn)為它們的作用是通過抑制蛋白酶的活性來保護(hù)繭絲，使其不被降解。
　　3.絲腺分泌的Serpin類絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達(dá)譜分析、純化及活性測定
　　(1)絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin16的抗體特異性檢測:

15、Serpin16是絲腺中含量最高的Serpin類絲氨酸蛋白酶抑制劑。我們利用實(shí)驗(yàn)室之前原核表達(dá)的Serpin16蛋白制備了多克隆抗體，通過結(jié)合雙向電泳、Western blot和MALDI-TOF-MS等技術(shù)驗(yàn)證了此抗體的特異性。利用雙向電泳分離5齡第3天的絲腺總蛋白，再進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)Serpin16的抗體能夠雜交到兩個(gè)蛋白點(diǎn)，命名為spot1和spot2。利用MALDI-TOF-MS對這兩個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，發(fā)

16、現(xiàn)spot1只包含了S erpin16特有的肽段，而spot2既包含了Serpin18特有的肽段也包含了Serpin22特有的肽段，表明S erpin16抗體能夠識別Serpin16、Serpin18和Serpin22三個(gè)蛋白。這是由于這三個(gè)蛋白的氨基酸序列同源性非常高而造成的。我們利用該抗體調(diào)查了S erpin16、Serpin18和Serpin22三個(gè)蛋白的表達(dá)特征。
　　(2) Serpin16、Serpin18和Serpi

17、n22的合成與分泌:半定量RT-PCR的結(jié)果表明家蠶Serpin16、Serpin18和Serpin2基因都在5齡第7天之前的家蠶中部絲腺前區(qū)表達(dá)。通過Western blot在蛋白水平也得到了類似的結(jié)果:Serpin16、Serpin18和Serpin22蛋白都存在于中部絲腺前區(qū)和前部絲腺中;Serpin16從5齡第1天到5齡第5天含量逐漸升高，之后含量降低;而Serpin18和Serpin22蛋白是從5齡初期到5齡第7天含量升高，之

18、后含量降低。Western blot和免疫熒光的結(jié)果表明它們主要分布于中部絲腺前區(qū)的腔內(nèi)。綜合以上結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)S erpin16、Serpin18和Serpin22從5齡初期到中期由家蠶中部絲腺前區(qū)細(xì)胞合成，然后分泌到絲腺腔中，吐絲之前含量開始減少。
　　(3) Serpin16、Serpin18和Serpin22的純化與活性測定:通過綜合利用陰離子交換層析和凝膠過濾的方法，我們從5齡第5天家蠶的中部絲腺前區(qū)腔內(nèi)容物中分離純化到

19、了Serpin16、Serpin18和Serpin22蛋白?；钚詼y定結(jié)果表明，它們對枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶具有較強(qiáng)的抑制活性，而對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶的抑制活性較低。由于這3個(gè)Serpin蛋白都存在于中部絲腺前區(qū)的腔內(nèi)，因此我們對中部絲腺前區(qū)腔內(nèi)的蛋白進(jìn)行酶活測定，結(jié)果表明5齡第5天蛋白酶活性還很低，但是到5齡第7天蛋白酶活性顯著升高，而Serpin16、Serpin18和Serpin22表現(xiàn)出對5齡第7天中

20、部絲腺前區(qū)腔內(nèi)蛋白酶活性的顯著抑制作用。綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在吐絲之前的5齡第7天，中部絲腺前區(qū)腔內(nèi)蛋白酶的活性顯著升高，與此同時(shí)，它們的抑制劑Serpin16、Serpin18和Serpin22的含量顯著降低。我們推測Serpin16、Serpin18和Serpin22可能的作用是將其靶蛋白酶限制于特定時(shí)期的絲腺的特定部位。
　　4.絲腺分泌的Serpin類絲氨酸蛋白酶抑制劑與蛋白酶的相互作用
　　(1)絲氨酸蛋白酶BmSP

21、82的表達(dá)特征分析:非標(biāo)定量的結(jié)果表明絲腺腔內(nèi)的絲氨酸蛋白酶BmSP82在絲腺中的含量遠(yuǎn)高于其它蛋白酶，且主要存在于中部絲腺前區(qū)，這與Serpin的表達(dá)特征類似，因此我們推測其是Serpin16、Serpin18和Serpin22的潛在靶酶。利用半定量RT-PCR技術(shù)，我們調(diào)查了BmSP82的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)BmSP82只在馬氏管和絲腺中表達(dá)，將絲腺細(xì)分為5個(gè)區(qū)段后，發(fā)現(xiàn)BmSP82在中部絲腺前區(qū)的表達(dá)量很高，在絲腺的其它區(qū)段表達(dá)量較低，

22、與Serpin16、Serpin18和Serpin22的組織表達(dá)特征類似。時(shí)期表達(dá)譜結(jié)果表明，BmSP82在整個(gè)5齡期都有較高的表達(dá)量，在5齡第5天到5齡第7天期間表達(dá)量最高，與Serpin16、Serpin18和Serpin22的時(shí)期表達(dá)特征不同。
　　(2)絲氨酸蛋白酶BmSP82與Serpin16、Serpin18和Serpin22的相互作用:我們成功構(gòu)建了BmSP82的重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母后，利用含G418的平板篩選

23、到了多拷貝轉(zhuǎn)化子，利用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)獲得了分泌到酵母細(xì)胞外的BmSP82蛋白。絲氨酸蛋白酶BmSP82酶原由N端的CUB結(jié)構(gòu)域和C端的催化結(jié)構(gòu)域兩部分組成。我們利用胰蛋白酶水解切割BmSP82酶原，使催化結(jié)構(gòu)域與CUB結(jié)構(gòu)域分離，從而激活成為成熟體酶。將成熟體酶與S erpin16、Serpin18和Serpin22蛋白進(jìn)行孵育，然后通過Western blot方法檢測，發(fā)現(xiàn)BmSP82與Serpin16、Serpin18和Serpin2