蛋白酶體抑制劑對自然殺傷細胞活性和功能影響的研究.pdf

1、泛素-蛋白酶體（Ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是哺乳動物細胞內主要的蛋白水解酶體系，參與和調控細胞的增殖、分化和凋亡。蛋白酶體主要由20S催化顆粒和19S調節(jié)顆粒兩部分組成，其活性狀態(tài)對維持細胞的正常功能起重要作用。蛋白酶體抑制劑可通過抑制蛋白酶體活性進而干擾和影響細胞功能，尤其對腫瘤細胞生長有明顯的抑制作用。蛋白酶體抑制劑硼替佐米（bortezomib，velcade）是近年研究較多的一種蛋白酶體抑

2、制劑，目前已被較廣泛地應用于多種惡性腫瘤特別是多發(fā)性骨髓瘤的治療。除了直接誘導腫瘤細胞凋亡外，硼替佐米尚可提高腫瘤細胞對自然殺傷（natural killer，NK）細胞殺傷的敏感性。然而，近年來研究發(fā)現硼替佐米對免疫細胞如T細胞和樹突細胞有一定的毒性作用，如誘導活化的T細胞凋亡，抑制樹突細胞活化T細胞的功能等。NK細胞是先天免疫細胞，在抗感染和抗腫瘤免疫中起著致關重要的作用。目前，有關硼替佐米對NK細胞功能調節(jié)作用的研究甚少。

3、 目的：研究蛋白酶體抑制劑硼替佐米對正常人外周血NK細胞活性和功能的影響，探討硼替佐米誘導NK細胞凋亡機制；觀察聯合應用硼替佐米與IL-12對多發(fā)性骨髓瘤SCID鼠皮下移植瘤生長及體內NK細胞殺傷活性的影響，研究IL-12與硼替佐米協(xié)同抗腫瘤作用以及IL-12抵抗硼替佐米對NK細胞的毒性作用。 方法: 1.體外研究硼替佐米對人外周血自然殺傷細胞活性和功能的影響 1.1硼替佐米對人外周血淋巴細胞或LAK細胞活性的影

4、響：采用淋巴細胞分離液分離正常人外周血單個核細胞，去除貼壁細胞后獲取懸浮細胞即外周血淋巴細胞（PBLs）。體外應用白介素-2（IL-2）誘導PBLs72h產生淋巴因子激活的殺傷（LAK）細胞。將PBLs、LAK細胞進行體外培養(yǎng)，給予不同濃度的硼替佐米處理12、24、48h，采用AnnexinⅤ（AV）和propidium iodide（PI）雙標進行流式細胞術檢測細胞凋亡情況。 1.2硼替佐米對人外周血自然殺傷細胞活性和功能的影

5、響：采用NK細胞陰性選擇試劑盒分離純化正常人NK細胞，流式細胞術檢測NK純度，將NK細胞進行體外培養(yǎng)，給予不同濃度的硼替佐米處理12、24h，或聯合應用GSH（氧自由基清除劑）或zVAD（全Caspase抑制劑）預處理，AV和PI雙標進行流式細胞術檢測細胞凋亡；熒光測定半胱天冬酶caspase-3活性的變化；Mitotracker Red熒光染色法測定線粒體膜電位的改變；細胞內染色法檢測穿孔素的表達；細胞表面染色檢測NK細胞膜活化性受體

6、的表達；分別以K562細胞和P815細胞作為靶細胞采用標準的4h51Cr釋放試驗檢測NK細胞的細胞毒作用或殺傷功能。 2.硼替佐米對骨髓瘤小鼠自然殺傷細胞活性和功能的影響 2.1建立SCID鼠多發(fā)性骨髓瘤皮下移植瘤模型：對數生長期的RPMI8226細胞，調整細胞數至1×108/ml，取0.1 ml含107個細胞接種于5-6周齡雌性SCID鼠前肢處背部皮下。14d后實體瘤長至直徑大于0.5cm時進行藥物干預。 2.

7、2荷瘤小鼠體內注射NS、硼替佐米和/或IL-12抑瘤效果觀察、NK細胞數變化及脾細胞殺傷功能SCID鼠皮下成瘤后隨機分成NS組、IL-12組（0.4ug/只）、硼替佐米組（0.75mg/kg）和硼替佐米+IL-12序貫治療組，分別給予腹腔注射IL-12，尾靜脈注射硼替佐米和NS，觀察荷瘤小鼠瘤體的生長抑制情況；干預前后取外周血做血常規(guī)及流式檢測NK細胞比例，末期取脾細胞懸液做LDH釋放實驗檢測NK細胞的殺傷功能。 結論: