蛋白酶體抑制劑MG-132抗人肝癌BEL-7402細胞的實驗研究.pdf

1、背景：肝癌是一種常見的惡性腫瘤，大多數(shù)病人預(yù)后差，診斷后中數(shù)生存期短于6個月。目前，化療仍是臨床上肝癌治療的主要手段。但傳統(tǒng)化療藥物的毒副作用大和腫瘤對化療的耐藥性是治療失敗的主要原因。尋找有效安全的抗腫瘤新藥成為肝癌研究的熱點。泛素．蛋白酶體通路是細胞內(nèi)蛋白降解的一個主要途徑。泛素化和蛋白酶體水解的底物包括許多負責細胞細胞周期和腫瘤生長的蛋白，如p53、p21、Bax、核因子抑制蛋白I-κB等。抑制這些蛋白降解，可導致腫瘤細胞增殖抑制

2、、凋亡發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑MG-132可抑制多種腫瘤細胞生長并誘導其凋亡，而對正常細胞無明顯抑制作用。 目的：本研究選用人肝癌BEL-7402細胞體外培養(yǎng)，探討蛋白酶體抑制劑MG-132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)對肝癌細胞增殖和凋亡的影響及分子機制，從細胞周期調(diào)控和凋亡信號傳導通路等方面揭示MG-132抗癌機理；聯(lián)合應(yīng)用MG-132與抗肝癌藥物表阿霉素作用于BEL-7402細胞，確定MG-132是否對表阿霉

3、素的抗肝癌作用具有化療增敏效應(yīng)，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法：體外培養(yǎng)的人肝癌細胞系BEL-7402，MG-132濃度設(shè)定為2.5、5.0、10.0μmol/L，未加MG-132組為對照組，采用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。(1)觀察2.5～10.0μmol/L MG-132人肝癌細胞系BEL一7402增殖動力學的影響：MTT法測細胞的生長抑制率；(2)流式細胞儀檢測細胞凋亡率、細胞周期；(3)透射電鏡觀察細胞的形態(tài)學變化；(4

4、)瓊脂糖凝膠電泳進行DNA片段分析觀察細胞凋亡；(5)比色法測半胱天冬酶caspase-3活性的變化；(6)免疫細胞化學方法檢測細胞p53、p21、Bax蛋白變化。第一部分：MG-132對BEL-7402細胞增殖和凋亡的影響 (1)MTT法檢測顯示，2.5～10.0μmol/L的MG-132對BEL-7402細胞均有抑制作用，抑制作用隨藥物濃度增加和作用時間延長而增強。 (2)流式細胞術(shù)檢測顯示MG-132能明顯誘導B

5、EL-7402細胞凋亡(5.01amol/L組、10.0gmol/L組與對照組相比，P均<0.01)；凋亡率均隨藥物濃度增加而升高，24h、48h二時間點，5.0μmol/L組與10.0μmol/L組相比，凋亡率有顯著差異，P<0.01；相同濃度作用的二時間點，凋亡率相比有顯著差異，P<0.01。 (3)透射電鏡下，經(jīng)5.0μmol/L MG-132作用48小時后，部分BEL-7402細胞出現(xiàn)細胞凋亡的典型形態(tài)學特征：細胞體積

6、縮小，細胞膜呈皺折狀凹陷。微絨毛減少甚至消失，胞漿濃縮，細胞器減少，染色質(zhì)固縮，邊緣化，有些細胞以出芽方式形成凋亡小體。 (4)瓊脂糖凝膠電泳進行DNA片段分析顯示經(jīng)5.0μmol/L，MG-132作用48小時后，出現(xiàn)明顯“階梯狀”條帶，而未用MG-132處理的對照組則無。 (5)BEL-7402細胞經(jīng)5.0μmol/L MG-132作用12、24小時后，流式細胞術(shù)顯示G<,2>/M期細胞比例增加，呈現(xiàn)一定時間-效應(yīng)關(guān)系

7、。第二部分：MG-132對BEL-7402細胞增殖抑制和凋亡誘導效應(yīng)的分子機制 (1)BEL-7402細胞經(jīng)5.0μmol/L MG-132作用12、24小時后，免疫細胞化學結(jié)果顯示p53、p21蛋白水平增高，分別與對照組相比，P均<0.001，且有時間-效應(yīng)關(guān)系。 (2)BEL-7402細胞經(jīng)5.0μmol/L MG-132作用24、48小時后，免疫細胞化學結(jié)果顯示Bax蛋白水平增高，與對照組相比，P均<0.001，

8、且有時間-效應(yīng)關(guān)系。 (3)比色法測BEL-7402細胞經(jīng)5.0μmol/L MG-132作用48小時后，caspase-3活性顯著升高，與對照組相比，P<0.05。第三部分：MG-132對表阿霉素抗肝癌BEL-7402細胞作用的化療增敏效應(yīng)及機制 (1)2.51μmol/L MG-132與100μg/L表阿霉素共同干預(yù)BEL-7402細胞，較之單用相應(yīng)劑量MG-132或表阿霉素抑制細胞的活力和誘導細胞凋亡作用增強。

9、 (2)單用2.5μmol/L MG-132及與100μg/L表阿霉素聯(lián)合作用BEL-7402細胞后相比對照組，Bax蛋白水平升高。 結(jié)論： (1)MG-132可以時間和劑量依賴方式抑制人肝癌BEL-7402細胞增殖，將其阻滯于G<,2>/M期，誘導其凋亡。 (2)MG-132可能通過提高細胞周期調(diào)節(jié)蛋白p53、p21和促凋亡蛋白Bax表達、阻斷細胞周期G<,2>期檢查點、激活caspase-3等途徑抑制B