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文檔簡介
1、目的:
伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma,BL)是起源于B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的一個(gè)特殊亞型,為來源于濾泡生發(fā)中心細(xì)胞的高度惡性腫瘤。其腫瘤細(xì)胞倍增時(shí)間短、侵襲性高,臨床上給予大劑量化療可使部分患者治愈。近年來,利妥昔單抗、自體造血干細(xì)胞移植等治療手段的臨床應(yīng)用于治療伯基特淋巴瘤使預(yù)后有所改善,但仍有部分患者難以治愈,急需尋找更為有效的治療手段。組蛋白去乙?;敢种苿?histonedeacetylaseinhi
2、bitor,HDACi)以表觀遺傳為治療靶點(diǎn),可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞組蛋白和非組蛋白的乙?;蕉{(diào)控基因的表達(dá),產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng),從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,并可以增強(qiáng)腫瘤對一些化療藥物的敏感性。蛋白酶體抑制劑通過特異性抑制泛素-蛋白酶體通路,阻斷蛋白酶體對蛋白的水解,從而阻滯腫瘤細(xì)胞生長及血管生成,進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤作用,其毒副作用較小,且與常規(guī)化療藥物無交叉耐藥性,可以抑制多種實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的增殖。
3、 近年來,關(guān)于兩類靶向藥物聯(lián)合治療套細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、急性T淋巴母細(xì)胞白血病及多發(fā)性骨髓瘤研究較多,提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用在血液系統(tǒng)惡性腫瘤疾病中有良好的前景。但兩藥聯(lián)合應(yīng)用于人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株生長調(diào)控的基礎(chǔ)研究國外偶有報(bào)道,國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)通過研究組蛋白去乙?;敢种苿㎜BH589聯(lián)合蛋白酶體抑制劑硼替佐米(bortezomib)對人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞生長調(diào)控的影響,探索其作用機(jī)制,以
4、期為臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),尋找伯基特淋巴瘤新的治療手段。
方法:
1.人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株raji細(xì)胞培養(yǎng)、傳代
人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,置于37℃、飽和濕度、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48-72h傳代一次。此時(shí)細(xì)胞生長良好,懸浮成團(tuán),臺盼蘭染色拒染率95%以上。本研究相
5、關(guān)實(shí)驗(yàn)均采用對數(shù)生長期Raji細(xì)胞進(jìn)行。
2.MTT法檢測組蛋白去乙?;敢种苿㎜BH589、蛋白酶體抑制劑硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對細(xì)胞增殖的影響
2.1LBH589抑制Raji細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
取Raji細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度約為2×105/ml,以每孔90μl接種于U型96孔板,隨機(jī)分為對照組和LBH589實(shí)驗(yàn)組。對照組加入等體積培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組分別加入LBH589并使其終濃度為1n
6、M、10nM、102nM、103nM、104nM,對照組及LBH589實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,分別于加入藥物后第24、48、72h向各孔中加入20μl的MTT(5mg/ml)溶液,繼續(xù)孵育4h,后離心培養(yǎng)板,吸去上清,向各孔中加入150μl二甲基亞砜,振蕩器振蕩至結(jié)晶充分溶解。調(diào)整酶標(biāo)儀至570nm條件下,測量各組吸光度值。
2.2硼替佐米抑制Raji細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
取Raji細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)
7、胞密度約為2×105/ml,接種96孔板,隨機(jī)分為對照組、硼替佐米實(shí)驗(yàn)組。對照組加入等體積培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為2nM、4nM、8nM、16nM、32nM硼替佐米,余同上述方法。
2.3LBH589+硼替佐米抑制Raji細(xì)胞增殖試驗(yàn)
取Raji細(xì)胞懸液,以約2×105/ml的密度接種96孔板,隨機(jī)分為對照組、LBH589組、硼替佐米組、LBH589+硼替佐米聯(lián)合用藥組,于加藥后第24h、48h、72h
8、測量各組吸光度值。
3.流式細(xì)胞術(shù)Annexin(V)/PI標(biāo)記法檢測LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對細(xì)胞凋亡率的影響
取Raji細(xì)胞懸液,隨機(jī)分為對照組、LBH589組、硼替佐米組和LBH589+硼替佐米組,培養(yǎng)箱中孵育36h,后收集細(xì)胞,預(yù)冷(4℃)PBS洗滌,向各管內(nèi)加入5μlAnnexinV/FITC及10μl碘化丙碇(PI),混勻后于室溫避光孵育15分鐘,使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測各
9、組Raji細(xì)胞凋亡率。4流式細(xì)胞術(shù)檢測LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對Fas蛋白表達(dá)率的影響
取Raji細(xì)胞懸液,隨機(jī)分為對照組、LBH589組、硼替佐米組和LBH589+硼替佐米組,培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞,預(yù)冷(4℃)PBS洗滌,加入Fas抗體,室溫、避光反應(yīng)1小時(shí)后加入二抗,應(yīng)用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測Raji細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)率。
5.流式細(xì)胞術(shù)檢測LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于
10、Raji細(xì)胞對bcl-2蛋白表達(dá)率的影響
取Raji懸液細(xì)胞,隨機(jī)分為對照組、LBH589組、硼替佐米組和LBH589+硼替佐米組,培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞,預(yù)冷(4℃)PBS洗滌,加入bcl-2抗體,室溫、避光反應(yīng)1h后加入二抗,應(yīng)用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測Raji細(xì)胞bcl-2蛋白的表達(dá)率。
6.Realtime-PCR檢測LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對NF-κB的mRNA表達(dá)水平的影響
11、r> 取Raji細(xì)胞懸液,隨機(jī)分為對照組、LBH589組、硼替佐米組和LBH589+硼替佐米組,培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞,根據(jù)RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒具體實(shí)驗(yàn)步驟檢測NF-κB的mRNA表達(dá)水平。
7.Westernblot法檢測LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平的影響。
取對數(shù)生長期Raji細(xì)胞,隨機(jī)分為對照組、LB
12、H589組、硼替佐米組和LBH589+硼替佐米組,培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞,提取各組細(xì)胞的總蛋白,取100μg蛋白上樣、SDS-PAGE電泳。印跡轉(zhuǎn)膜后,加入抗NF-κB(p65)抗體孵育,后加入二抗,用顯色劑顯色成像。
結(jié)果:
1.MTT法檢測組蛋白去乙酰化酶抑制劑LBH589、蛋白酶體抑制劑硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對細(xì)胞增殖的影響
1)人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞經(jīng)不同濃度(1
13、nM、10nM、100nM、1000nM、10000nM)LBH589作用24h、48h、72h后,應(yīng)用MTT法檢測各標(biāo)本吸光度值均有不同程度減低,LBH589對Raji細(xì)胞株有抗增殖活性。相同處理時(shí)間條件下,隨著LBH589濃度的增加,Raji細(xì)胞抑制率逐漸升高;相同濃度LBH589條件下,隨著處理時(shí)間的延長,Raji細(xì)胞抑制率逐漸升高。對于Raji細(xì)胞,LBH589作用時(shí)間與濃度對抑制率均有影響,其效應(yīng)具有時(shí)間-劑量依賴性。2)Ra
14、ji細(xì)胞經(jīng)不同濃度(2nM、4nM、8nM、16nM、64nM)硼替佐米作用24h、48h、72h后,應(yīng)用MTT法檢測各標(biāo)本吸光度值均有不同程度減低,硼替佐米對Raji細(xì)胞株有抗增殖活性。相同處理時(shí)間條件下,隨著硼替佐米濃度的增加,Raji細(xì)胞抑制率逐漸升高;相同濃度硼替佐米條件下,隨著處理時(shí)間的延長,Raji細(xì)胞抑制率逐漸升高。對于Raji細(xì)胞,硼替佐米作用時(shí)間與濃度對抑制率均有影響,其效應(yīng)具有時(shí)間-劑量依賴性。3)當(dāng)LBH589和硼
15、替佐米聯(lián)用時(shí),Raji細(xì)胞抑制率明顯升高,如Raji細(xì)胞經(jīng)10nMLBH589、4nM硼替佐米、10nMLBH589+4nM硼替佐米處理24h后,細(xì)胞抑制率依次為(7.53±3.02)%、(10.15±2.83)%、(26.74±2.80)%,兩藥聯(lián)用可以協(xié)同抑制Raji細(xì)胞的增殖。
2.流式細(xì)胞術(shù)Annexin(V)/PI標(biāo)記法檢測LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對細(xì)胞凋亡率的影響:在一定濃度范圍內(nèi),L
16、BH589單藥或硼替佐米單藥均可以誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡,且隨著提高藥物濃度后細(xì)胞凋亡率有所升高。當(dāng)LBH589和硼替佐米聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞時(shí),細(xì)胞凋亡率明顯增加。
3.流式細(xì)胞術(shù)檢測LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對Fas蛋白表達(dá)率的影響:與對照組相比,LBH589單藥可上調(diào)Raji細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)率,而硼替佐米單藥處理Raji細(xì)胞的Fas蛋白表達(dá)率無明顯變化。
4.流式細(xì)胞術(shù)檢測L
17、BH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞對Bcl-2蛋白表達(dá)率的影響:與對照組相比,LBH589單藥或硼替佐米單藥均可下調(diào)Raji細(xì)胞bcl-2蛋白的表達(dá)率,當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí),表達(dá)率明顯下調(diào)。
5.Realtime-PCR方法檢測LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合組作用于Raji細(xì)胞后NF-κBmRNA表達(dá)水平變化:在一定濃度范圍內(nèi),LBH589單藥或硼替佐米單藥均可下調(diào)NF-κBmRNA的表達(dá)水平,且隨藥物濃度增加NF
18、-κBmRNA表達(dá)水平下調(diào),兩藥聯(lián)用時(shí),作用明顯增強(qiáng)。
6.WesternBlot法檢測LBH589、硼替佐米及兩藥聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞后NF-κB(p65)蛋白表達(dá)的影響:LBH589單藥或硼替佐米單藥均可下調(diào)NF-κB(p65)蛋白的表達(dá),當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí),作用明顯增強(qiáng)。
結(jié)論:
1.在一定的濃度范圍內(nèi),組蛋白去乙酰化酶抑制劑LBH589可以抑制伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋
19、亡,機(jī)制可能與上調(diào)Fas蛋白、下調(diào)bcl-2蛋白和NF-κB(p65)蛋白的表達(dá)相關(guān)。
2.在一定的濃度范圍內(nèi),蛋白酶體抑制劑硼替佐米可以抑制人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,機(jī)制可能與下調(diào)bcl-2蛋白和NF-κB蛋白的表達(dá)相關(guān)。
3.在一定的濃度范圍內(nèi),組蛋白去乙酰化酶抑制劑LBH589聯(lián)合蛋白酶體抑制劑硼替佐米可以協(xié)同抑制人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,機(jī)制可能
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