家蠶SCPx-SCP2基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、膽固醇是昆蟲細(xì)胞膜成分，同時(shí)，更主要的作用是作為蛻皮激素的前體。由于昆蟲體內(nèi)缺少2種關(guān)鍵性的合成酶，昆蟲不能通過自身從頭合成膽固醇。事實(shí)上，昆蟲主要依賴食物中的膽固醇來滿足生長，發(fā)育和繁殖的需要。中腸是吸收轉(zhuǎn)化膽固醇的主要部位，然后通過血淋巴中的脂蛋白，運(yùn)送到前胸腺轉(zhuǎn)化利用；或是運(yùn)送到脂肪體以自由的膽固醇和膽固醇酯儲存起來。因而，昆蟲膽固醇代謝研究的重點(diǎn)集中在膽固醇代謝運(yùn)輸系統(tǒng)。 SCP2蛋白是動物中廣泛存在的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。哺乳

2、動物中SCPx/pro-SCP2基因是一個(gè)融合基因，其中SCP2蛋白的主要功能是參與膽固醇和脂肪酸的代謝，在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸膽固醇及脂類。SCP2能將細(xì)胞中的類固醇物質(zhì)運(yùn)載到線粒體，形成類固醇激素，如昆蟲的蛻皮激素；吸收自由的膽固醇形成細(xì)胞膜等。 本研究首先對家蠶SCPx/SCP2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測了這個(gè)基因核酸、mRNA、和蛋白質(zhì)情況；利用RT-PCR，克隆了這個(gè)基因并調(diào)查該基因在不同組織、不同時(shí)期的表達(dá)情況；最后，通過p

3、ET表達(dá)系統(tǒng)將家蠶SCPx蛋白和SCP2蛋白進(jìn)行體外表達(dá)，為以后的功能研究奠定基礎(chǔ)。 以棉鈴蟲SCPx基因?yàn)閰⒄?，?jīng)過生物信息學(xué)分析，在家蠶基因組中找到了家蠶的SCPx/SCP2基因組序列，長為8902bp?；诨蚪Y(jié)構(gòu)預(yù)測，推測家蠶SCPx/SCP2基因有2個(gè)編碼區(qū)1個(gè)內(nèi)含子。用DNAstar軟件將EST進(jìn)行拼接，結(jié)果得到2個(gè)contigs。將家蠶的BmSCPx/BmSCP2基因在cDNA水平進(jìn)行克隆、測序和分析，得到了家蠶B

4、mSCPx/SCP2的編碼區(qū)完整的序列。通過分析發(fā)現(xiàn)，該基因存在兩種拼接形式，即BmSCPx和BmSCP2兩種的mRNA形式。其中，BmSCPx長2165nt，BmSCP2長1035nt。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)BmSCPx/SCP2基因的確有選擇性拼接形式的存在，其中BmSCP2這種形式缺少了編碼硫解酶結(jié)構(gòu)域的區(qū)段的序列。 BmSCPx蛋白由536個(gè)氨基酸組成，BmSCP2蛋白由146個(gè)氨基酸組成。在線工具預(yù)測，發(fā)現(xiàn)BmSCPx蛋白

5、包含硫解酶-N,硫解酶-C和SCP2結(jié)構(gòu)域。BmSCP2蛋白只含有SCP2結(jié)構(gòu)域。BmSCPx和BmSCP2蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)分別是57.8kD、16.2kD和6.54、9.22。使用BLAST軟件分析發(fā)現(xiàn)，BmSCPx蛋白與棉鈴蟲SCPx蛋白有88﹪同源性和94﹪相似性。與果蠅SCPx蛋白有64﹪同源性和79﹪相似性。按蚊SCPx蛋白65﹪同源性和76﹪相似性。并且無論是BmSCPx蛋白，還是BmSCP2蛋白，在C端都有Ser-L

6、ys-Leu結(jié)構(gòu)過氧化酶體的靶序列，是一個(gè)高度保守的蛋白。 RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，BmSCPx/SCP2基因只在中腸和馬氏管以選擇性拼接的方式特異表達(dá)，其中，中腸的表達(dá)量要高很多。中腸時(shí)期表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)最早在4齡能檢測到兩種mRNA，整個(gè)5齡表達(dá)量都很高，在5齡3天達(dá)到最高峰，而在預(yù)化蛹時(shí)期卻只能檢測到BmSCP2，到成蟲期BmSCPx和BmSCP2都檢測不到。然而，BmSCP2的mRNA幾乎在所有組織都能檢測到。 另外

7、，本研究通過pET原核表達(dá)系統(tǒng)對BmSCPx和BmSCP2進(jìn)行提外表達(dá)。在IPTG的誘導(dǎo)下，在60kD處和約20kD處出現(xiàn)明顯濃粗的新蛋白質(zhì)帶。pET28(a)表達(dá)載體中His標(biāo)簽是2.39kD，而表達(dá)產(chǎn)物BmSCPx蛋白的分子量在57.85kD左右，BmSCP2蛋白的分子量在16.20kD左右。所以，與His的融合蛋白的分子量分別是：60.24kD和18.59kD。 SCP2蛋白是參與膽固醇在細(xì)胞內(nèi)各個(gè)細(xì)胞器間循環(huán)運(yùn)輸?shù)闹饕?/p>

8、白，對其基因結(jié)構(gòu)及蛋白功能的研究將有助于我們對昆蟲的膽固醇代謝有更為清楚的認(rèn)識。本研究采用生物信息學(xué)分析、基因克隆，表達(dá)譜分析等研究方法對家蠶的SCPx/SCP2基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了兩種不同的基因表達(dá)形式，它們在不同時(shí)期不同組織間存在表達(dá)差異，暗示著它們在代謝過程中將起到不同的作用。此外，本研究通過體外表達(dá)的SCPx蛋白和SCP2蛋白也為SCP2抑制劑(SCPIs)的研究提供研究平臺，它可以為鱗翅目農(nóng)林害蟲的防治提供研究基礎(chǔ)，具有相當(dāng)