家蠶mago nashi基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)研究.pdf

1、生殖質(zhì)是在許多物種卵子發(fā)生中形成的一種特殊細(xì)胞質(zhì)成分，含有這種成分的細(xì)胞才能發(fā)育為生殖細(xì)胞。對(duì)果蠅研究表明，magonashi基因是生殖質(zhì)組裝和形成的一個(gè)關(guān)鍵基因，其編碼的蛋白質(zhì)能識(shí)別并結(jié)合某些生殖質(zhì)決定基因的RNA，形成復(fù)合體，穿過核膜進(jìn)入核質(zhì)區(qū)域，指導(dǎo)生殖質(zhì)的正確組裝形成。從低等的真核生物酵母到高等的哺乳動(dòng)物人，都存在magonashi的同源基因并且相似性非常高。 為進(jìn)一步闡明家蠶生殖發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，在家蠶基因組、EST數(shù)據(jù)

2、以及芯片數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，本論文對(duì)果蠅中已報(bào)道的生殖質(zhì)決定相關(guān)基因在家蠶中的同源基因進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了分析，然后對(duì)高度保守的magonashi基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，以期為以后深入了解該基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，獲得結(jié)果如下： 1.果蠅生殖質(zhì)決定相關(guān)基因在家蠶中的同源基因分析從FlyBase下載果蠅生殖質(zhì)形成相關(guān)基因18個(gè)(aubergine，spire，nanos，torso，tudor，vasa，pumilio

3、,par-1，cappuccino，staufen，oskar，valois，germ-cellless,polar-granulecomponent，mtlrRNA，magonashi，tsunagi，exuperantia)，通過與家蠶基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)除oskar，valois，germ-cellless,polargranulecomponent，mtlrRNA5個(gè)基因外，其余13個(gè)基因在家蠶中均有同源基因，

4、并根據(jù)基因芯片數(shù)據(jù)分析了預(yù)測(cè)的家蠶生殖質(zhì)形成相關(guān)基因的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)在這些同源的生殖質(zhì)形成相關(guān)基因中，有5個(gè)基因(Bmcapu，Bmnos，Bmvas，Bmaub，Bmexu)在雌雄發(fā)育后期有顯著差異表達(dá)；有4個(gè)基因(Bmtud，Bmmago，Bmtsu，Bmstau)在雌雄發(fā)育過程中無差異表達(dá)；有3個(gè)基因(Bmnos，Bmvas，Bmaub)在生殖腺中特異表達(dá)；有6個(gè)基因(Bmcapu，Bmmago，Bmtsu，Bmexu，Bmsta

5、u，Bmtud)除在生殖腺中表達(dá)外，還在其它組織有高表達(dá)。 2.家蠶magonashi基因的克隆及mRNA表達(dá)檢測(cè)根據(jù)預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序驗(yàn)證，成功地克隆到家蠶magonashi基因完整的編碼區(qū)序列。分析發(fā)現(xiàn)該基因位于nscaf2655上，只有一個(gè)完整的拷貝，在基因組上有1611bp，共有兩個(gè)外顯子，分別為258bp和183bp，并且外顯子、內(nèi)含子邊界符合典型的GT-AG結(jié)構(gòu)?？寺〉膍agonashi

6、基因完整的編碼區(qū)序列為441bp，編碼146個(gè)氨基酸殘基。RT-PCR檢測(cè)了該基因在發(fā)育各時(shí)期各組織器官的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因在所檢測(cè)的所有發(fā)育時(shí)期、組織器官均有表達(dá)，是一個(gè)非特異表達(dá)基因。 3.家蠶magonashi基因的原核表達(dá)將家蠶magonashi基因的編碼區(qū)序列克隆到原核表達(dá)載體pET28-a中，并將構(gòu)建成的pET-magonashi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)細(xì)胞，IPTG誘