百合ACO基因的克隆及原核表達(dá)分析.pdf

1、在前期研究工作的基礎(chǔ)上，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室所獲得的ACO基因序列進(jìn)一步的研究，分析與其它物種所得到的序列相似性關(guān)系，進(jìn)行該基因序列的原核表達(dá)和分析其蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)取得的結(jié)果如下： 1.亞洲百合‘Polyarma’ACO基因eDNA．全長(zhǎng)克隆及序列分析在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)得到百合ACO基因片斷設(shè)計(jì)一對(duì)末端擴(kuò)增的特異引物，采用RACE方法，克隆獲得了亞洲百合‘Polyaana’ACO基因的完整eDNA序列，長(zhǎng)1152 bp。該序列有954 b

2、p的開放閱讀框，編碼318個(gè)氨基酸。暫命名為L(zhǎng)ACO。序列登錄到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為：EU296623。序列比對(duì)表明，LACO核苷酸序列與其它植物已報(bào)道的ACO基因具有71％-82％的相似性，氨基酸序列有70％-87％的相似性。 2.亞洲百合‘Polyanna’ACO基因DNA克隆及序列分析以亞洲百合‘Polyanna’DNA為模板，根據(jù)已得到的完整開放閱讀框區(qū)域設(shè)計(jì)引物，克隆得到了LACO的部分DNA．序列，長(zhǎng)972

3、 bp，分析發(fā)現(xiàn)在開放閱讀框內(nèi)沒有內(nèi)含子。 3.亞洲百合‘Polyanna’ACO基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)、重組蛋白的純化。 構(gòu)建了ACO基因原核表達(dá)的載體pGEX-ACO，根據(jù)序列分析表明，目的基因按正確的閱讀框架插入到表達(dá)載體中。篩選出陽(yáng)性重組載體，用0.4 m MIPTG分別在20℃、25℃、28℃、30℃、33℃和37℃誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物通過12％SDS-PAGE分析，證明ACO基因在大腸桿菌中成功得到了表達(dá)，表