葡萄白藜蘆醇合酶基因的克隆及原核表達(dá)研究.pdf

1、本試驗的目的是從中國葡萄屬野生種華東葡萄白河中克隆白藜蘆醇合酶基因，然后構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21中表達(dá)白藜蘆醇合酶，從而獲得一種新型的功能性微生態(tài)制劑基因工程菌種。 白藜蘆醇合酶是催化合成白藜蘆醇的關(guān)鍵酶。白藜蘆醇(三羥基反式芪)存在于少數(shù)幾種植物中，藥理學(xué)的研究表明，它具有抗氧化、抗菌、抗炎癥等重要生理活性。對該酶及其基因的研究使我們可以有效的利用白藜蘆醇。 本試驗采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)的方法，首

2、先從葡萄葉片中提取總RNA，利用其中mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用白藜蘆醇合酶基因引物，以cDNA為模板擴(kuò)增出目的基因?；厥占兓笤儆脦в忻盖形稽c的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，引入限制性酶切位點。 回收純化目的基因，將其克隆到克隆載體pGEM-TEasy上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T-RS，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，酶切鑒定后送檢測序。結(jié)果表明，目的基因的長度為1179bp，編碼392個氨基酸，與Genbank中己有的幾個葡萄白藜蘆醇合酶基

3、因序列相似性為96％-98％，氨基酸序列相似性為97％-99％。 從重組質(zhì)粒中切下目的基因，回收純化后亞克隆到原核表達(dá)載體pET-22b(+)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-RS，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進(jìn)行抗性篩選及酶切鑒定，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 培養(yǎng)重組菌株，利用比濁法研究其生長曲線，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4h后菌株進(jìn)入對數(shù)生長期。在對數(shù)生長期用IPTG誘導(dǎo)重組菌，超聲波破碎菌體，收集上清液。最后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，表明